肖秀英，吳華兵，詹瑋瑋

大腦海馬是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最復(fù)雜的部位[1]。海馬神經(jīng)元主要由海馬神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成，當(dāng)海馬神經(jīng)細(xì)胞受損后會(huì)引起記憶功能減退、學(xué)習(xí)能力降低、認(rèn)知發(fā)生障礙等癥狀[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，麻醉在各種手術(shù)中扮演著重要角色，其中七氟烷是目前臨床上使用較為廣泛的吸入類麻醉劑[3]。既往研究顯示，七氟烷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶功能都有潛在損傷，吸入量過多會(huì)嚴(yán)重影響海馬神經(jīng)細(xì)胞并導(dǎo)致其凋亡[4]。丙泊酚是一種臨床常用的靜脈麻醉藥，多用于腫瘤切除手術(shù)的麻醉[5]。丙泊酚可以減輕七氟烷帶來的應(yīng)激反應(yīng)；同時(shí)可以通過調(diào)節(jié)核因子-κB(NF-κB)通路和炎癥反應(yīng)因子活性，對心腦血管起到保護(hù)作用[6]。目前有關(guān)丙泊酚治療七氟烷引起大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷及認(rèn)知障礙的相關(guān)機(jī)制尚不完全統(tǒng)一。本文旨在探究丙泊酚對七氟烷引起大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷及認(rèn)知障礙的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級雄性SD大鼠60只，3周齡，體重(200±15)g，均由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：粵監(jiān)證字2004A029號。本實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3-R原則同時(shí)已獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對照組、七氟烷組、聯(lián)合組，每組20只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 丙泊酚注射液(四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H20030115)；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體均購自Santa Cruze Biotechnology 公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自四季青公司；白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)試劑盒子購自美國Sigma公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 生化分析儀(型號：Sysmex-chemix-180)購自日本Furuno Electric公司；電子天平(型號：BS-124s)購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；正置型金相顯微鏡(型號：SG-51)購自上海光學(xué)儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司；LD-66實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)購自長沙益廣制藥機(jī)械公司。流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)購自美國Beckman公司。

1.4藥物干預(yù)方法 七氟烷組每天吸入1.5%七氟烷1 h；聯(lián)合組在七氟烷組基礎(chǔ)上加用丙泊酚注射液150 mg/kg；對照組給予等量生理鹽水。3組均給藥14 d。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1大鼠神經(jīng)功能檢測：3組均于藥物干預(yù)24 h后，分別使用Y-迷宮實(shí)驗(yàn)及Longa評分法評價(jià)大鼠神經(jīng)功能[7]。①Y-迷宮實(shí)驗(yàn)：在Y-迷宮中控制儀釋放電擊電壓為70 V、延遲2 s的電刺激來電擊大鼠足部?？刂苾x中的反射箱頂端有3有個(gè)信號燈，根據(jù)燈光信號電擊大鼠，讓大鼠逃離至安全區(qū)域。記錄各組錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)和逃離時(shí)間。②Longa評分法：評分為5個(gè)等級，0分為正常，大鼠無神經(jīng)功能缺損；1分為大鼠左側(cè)前爪不能完全伸展；2分為大鼠行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分為大鼠行走時(shí)向左側(cè)傾；4分為大鼠不能自發(fā)行走。評分越高提示大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5.2蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平：3組完成神經(jīng)功能檢測后，將大鼠使用斷脖法處死，取其大腦海馬區(qū)組織，剪碎后用胰蛋白酶消化，提取總蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，常規(guī)封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，并孵育，本研究使用的內(nèi)參蛋白為β-actin，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對表達(dá)量。

1.5.3細(xì)胞凋亡檢測：取3組大鼠的海馬區(qū)組織，使用胰蛋白酶消化為單層細(xì)胞離心，4℃、離心5 min；收集細(xì)胞后加入Binding Buffer重懸細(xì)胞100 μl、Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，避光孵育后加入Binding Buffer；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5.4血清炎性因子檢測：斷脖法處死大鼠后，取其血液離心，1500 r/min、離心15 min，取去上清液后的沉淀，按照試劑盒操作方法檢測IL-6、TNF-α、IL-1β含量。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能比較 與對照組相比，七氟烷組逃離時(shí)間、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)和Longa評分顯著升高(P<0.05)。與七氟烷組相比，聯(lián)合組逃離時(shí)間、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)和神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠神經(jīng)功能檢測比較

2.2大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較 3組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率分別為：對照組(7.58±0.29)%、七氟烷組(31.69±2.35)%、聯(lián)合組(15.21±1.03)%。與對照組相比，七氟烷組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與七氟烷組相比，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況比較

2.3大鼠海馬區(qū)凋亡蛋白表達(dá)比較 與對照組相比，七氟烷組Bax蛋白和Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與七氟烷組相比，聯(lián)合組Bax蛋白和Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 3組大鼠海馬區(qū)Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)情況

表2 3組大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較

2.4大鼠血清炎性因子比較 與對照組比較，七氟烷組血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與七氟烷組比較，聯(lián)合組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較

3 討論

吸入七氟烷與記憶損傷程度密切相關(guān)，吸入七氟烷會(huì)對海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控通道有影響[8]；也會(huì)在腦發(fā)育過程中對海馬CA1 區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控通道產(chǎn)生抑制作用，找到減少七氟烷麻醉帶來的認(rèn)知功能障礙和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡一直是麻醉學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。丙泊酚作為一種靜脈全身麻醉藥被廣泛應(yīng)用，其腦保護(hù)作用也有較多研究[9-10]。本研究結(jié)果顯示，與七氟烷組相比，聯(lián)合組大鼠逃離時(shí)間、錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)和Longa評分顯著降低，說明對于七氟烷引起大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，丙泊酚可使大鼠神經(jīng)功能和記憶功能得到有效改善。與王潔和王建華[11]報(bào)道的丙泊酚麻醉可有效降低患者術(shù)后認(rèn)知障礙發(fā)生率的結(jié)論一致。

海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡是引起大鼠神經(jīng)功能受損的重要因素之一[12]，而細(xì)胞凋亡受各種基因調(diào)控。目前研究較多的基因包括Caspase家族和Bcl-2家族基因，Caspase家族中Caspase-3和caspase-9等是Caspase最常見的凋亡因子[13]。Caspase-9主要作用是通過自身裂解使得proCaspase-3 產(chǎn)生有活性的Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除了Caspase家族蛋白可以調(diào)控細(xì)胞凋亡外，Bcl-2家族的Bcl-2蛋白和Bax蛋白也可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡[14-15]。本研究結(jié)果顯示，與七氟烷組相比，聯(lián)合組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率顯著降低；說明丙泊可以明顯降低海馬區(qū)細(xì)胞的凋亡水平。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，與七氟烷組相比，聯(lián)合組Bax蛋白和Caspase-3蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平顯著升高。說明丙泊酚可以升高抑制凋亡蛋白的表達(dá)水平，抑制海馬細(xì)胞凋亡，從而使大鼠的神經(jīng)功能得到顯著的改善。與胡洪憑等[16]報(bào)道的丙泊酚通過激活相關(guān)信號通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)論一致。

大鼠海馬組織受到損傷后會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，可使Th1細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子，主要為TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8等[17-18]。本研究結(jié)果顯示，與七氟烷組相比，聯(lián)合組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低。這可能與丙泊酚可使NF-κB和NLRP3炎性體激活，抑制炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞有關(guān)；與于文娟等[19]報(bào)道一致，該研究認(rèn)為丙泊酚可抑制炎癥反應(yīng)，影響大鼠認(rèn)知功能。

綜上所述，丙泊酚可以緩解七氟烷引起大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制與抑制海馬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)。