方 侃，呂光輝，汪新體，艾志兵，王啟斌

隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加劇，阿爾茨海默病(alzheimer's disease, AD)已成為嚴(yán)重危害中老年人心身健康的公共衛(wèi)生問題；其發(fā)病機(jī)制不明，亦無(wú)有效治療藥物。輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment, MCI)是介于正常衰老和癡呆之間的一種不穩(wěn)定的臨床狀態(tài)；其既有認(rèn)知功能的可逆性，又可以逐漸加重并最終發(fā)展為AD。65歲以上MCI患者AD的發(fā)病率為10%～15%。因此，正確認(rèn)識(shí)和有效干預(yù)MCI對(duì)早期防治AD具有重要意義[1-5]。目前在MCI動(dòng)物模型的研究中存在3個(gè)問題[6-9]：一是完全沿襲AD的造模過程，以至于不能準(zhǔn)確把握MCI的病理生理階段；二是制模因素單一、過程偏短，只是在一個(gè)點(diǎn)或一個(gè)局部表達(dá)MCI的急性病理變化；三是認(rèn)知功能障礙的可逆性無(wú)法驗(yàn)證。因此，必須嘗試建立具有臨床MCI特征的動(dòng)物模型以探索該病的病因、發(fā)病機(jī)制及有效干預(yù)措施。衡量MCI動(dòng)物模型的是表面效度(類似人MCI行為表現(xiàn))、結(jié)構(gòu)效度(類似人MCI病理學(xué)改變)及預(yù)測(cè)效度(模型行為學(xué)改變可逆轉(zhuǎn))。有氧運(yùn)動(dòng)可以通過多種機(jī)制有效減緩癡呆患者的認(rèn)知障礙速度[10-13]。本研究采用D-半乳糖(D-galactose, D-gal)、三氯化鋁和亞硝酸鈉聯(lián)合作用構(gòu)建MCI小鼠模型，觀察了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)MCI模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退及海馬組織病理學(xué)改變的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性昆明小鼠90只，16月齡，體重50～55 g，SPF級(jí)，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)[SYXK(鄂)2016-0031]，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2016-0008。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食，光照12 h/d，室溫(22±2)℃，濕度(50～60)%。本項(xiàng)目經(jīng)學(xué)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員審查批準(zhǔn)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 SA101小動(dòng)物跑臺(tái)(江蘇賽昂斯公司)；MT-200水迷宮行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟公司)；D-gal(美國(guó)Amresco公司)；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, ChAT)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase, AchE)、β-淀粉樣蛋白42(amyloid beta 42, Aβ42)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)elabscience公司，改良Bielschowsky神經(jīng)染色液(武漢卡諾斯公司)，熱電Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組及MCI小鼠模型復(fù)制：將90只小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、MCI模型組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組，每組30只。MCI模型組、運(yùn)動(dòng)干預(yù)組小鼠給予100 g/L的D-gal(500 mg/kg)、9 g/L的亞硝酸鈉(45 mg/kg)，頸背部皮下注射；同時(shí)給予三氯化鋁(40 mg/kg)灌胃；連續(xù)3周。對(duì)照組以相同給藥方式給予等量無(wú)菌生理鹽水。

1.3.2跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)：對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)組實(shí)施中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)。①適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練：第1天運(yùn)動(dòng)速度為每分鐘12 m，訓(xùn)練時(shí)間為20 min；隨后運(yùn)動(dòng)速度不變、訓(xùn)練時(shí)間每天增加10 min，直至60 min/d，共5 d。②正式訓(xùn)練：坡度為0°，第1周運(yùn)動(dòng)速度設(shè)定為每分鐘15 m，以后每1周增加運(yùn)動(dòng)速度(每分鐘增加3 m)，直至每分鐘24 m；每天訓(xùn)練60 min，每周連續(xù)訓(xùn)練5 d，共訓(xùn)練3周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1行為學(xué)測(cè)試：①定位航行實(shí)驗(yàn)：記錄3組大鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間(逃避潛伏期)；若>60 s未找到平臺(tái)則計(jì)逃避潛伏期為60 s；連續(xù)5 d。②空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日撤除平臺(tái)，記錄3組大鼠第1次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間及在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間。

1.4.2海馬取材、固定：水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取腦，迅速分離并取下海馬組織。取3組小鼠一側(cè)海馬組織(左側(cè)或右側(cè)，隨機(jī))裝入EP管，投入液氮中，用于ELISA等檢測(cè)；另一側(cè)海馬組織投入4%的多聚甲醛溶液中固定過夜，用于染色標(biāo)本的制作。

1.4.3海馬勻漿ChAT、AchE活性及Aβ42含量測(cè)定：從液氮中取出海馬組織，平衡溫度后稱重，按質(zhì)量/體積比(1∶9)加入4℃生理鹽水勻漿。勻漿液置于離心機(jī)(轉(zhuǎn)速3000 r/min、半徑13.5 cm)中離心15 min，取上清分裝于EP管，置于-20℃冰箱待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明，用ELISA檢測(cè)海馬勻漿中ChAT、AchE活性及Aβ42含量。

1.4.4海馬切片制備及染色：將海馬組織在多聚甲醛中過夜，于次日行石蠟包埋，制作石蠟切片，連續(xù)冠狀位切片，厚度為10 μm。一部分切片做HE染色；另一部分切片按照改良Bielschowsky神經(jīng)染色液說(shuō)明書進(jìn)行銀染：將切片浸染于銀溶液中，之后用還原劑處理，使神經(jīng)元、軸突及神經(jīng)纖維呈現(xiàn)深棕色或黑色。

2 結(jié)果

2.1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 與對(duì)照組相比，MCI模型組小鼠逃避潛伏期、第1次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間延長(zhǎng)，在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MCI模型組比較，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組逃避潛伏期、第1次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間縮短，在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.2小鼠海馬勻漿ChAT、AchE活性及Aβ42含量比較 與對(duì)照組比較，MCI模型組海馬ChAT表達(dá)水平明顯降低，而AchE、Aβ42表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MCI模型組比較，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組海馬ChAT表達(dá)水平明顯升高，而AchE、Aβ42表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠腦勻漿ChAT、AchE活性及Aβ42含量比較

2.3小鼠海馬組織病理學(xué)改變 對(duì)照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)纖維排列整齊。MCI模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞密度下降，部分細(xì)胞核固縮、深染，可見少量的細(xì)胞凋亡，神經(jīng)纖維排列稍稀疏。運(yùn)動(dòng)干預(yù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞密度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及神經(jīng)纖維排列清晰、有序，未見凋亡細(xì)胞。見圖1。

圖1 3組小鼠海馬組織病理學(xué)改變(HE×400，15個(gè))

2.4小鼠海馬神經(jīng)元纖維和Aβ斑的形態(tài)比較 對(duì)照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，其神經(jīng)元纖維清晰、規(guī)則、呈棕黑色，且伸入細(xì)胞突起內(nèi)；細(xì)胞外未見Aβ斑。MCI模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稍稀疏，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞神經(jīng)元纖維稍增粗、模糊；細(xì)胞外未見Aβ斑。運(yùn)動(dòng)干預(yù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列有序，細(xì)胞神經(jīng)元纖維清晰；細(xì)胞外未見Aβ斑。見圖2。

圖2 3組小鼠海馬神經(jīng)元纖維和Aβ斑病理形態(tài)(Bielschowsky×400，15個(gè))

3 討論

隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加劇，AD已成為危害老年人身心健康的嚴(yán)重社會(huì)公共問題；AD發(fā)病機(jī)制不明，尚無(wú)有效藥物和治療技術(shù)[14-15]。目前基于Aβ毒性學(xué)說(shuō)開發(fā)的抗AD藥物在臨床三期試驗(yàn)中失敗，讓更多研究團(tuán)隊(duì)將注意力投入到探索MCI干預(yù)途徑和機(jī)制上，試圖從源頭上防治AD。

D-gal是一種還原糖，在正常濃度狀態(tài)下代謝生成葡萄糖，而高劑量時(shí)形成活性氧簇如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等及高級(jí)糖化終末產(chǎn)物，通過氧化應(yīng)激等機(jī)制，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)，引起海馬神經(jīng)元退行性病變[16-17]。鋁是一種慢性神經(jīng)毒素，三氯化鋁除介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化外，還可以引起腦組織神經(jīng)元纖維變性、β-淀粉樣蛋白的過表達(dá)[18]。亞硝酸鈉的氧化性導(dǎo)致血紅蛋白失去攜氧輸氧功能，使腦組織產(chǎn)生缺氧性中毒。本課題組前期研究表明，D-gal、亞硝酸鈉和三氯化鋁三者復(fù)合慢性作用是建立AD動(dòng)物模型的比較理想的方法[8-9,19]。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，MCI模型組逃避潛伏期、第1次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間延長(zhǎng)，在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間縮短；海馬ChAT水平明顯降低，而AchE、Aβ42水平明顯升高；MCI模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞密度下降，部分細(xì)胞核固縮、深染，少量細(xì)胞凋亡，神經(jīng)纖維也排列稍稀疏；銀染示MCI模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稍稀疏，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞神經(jīng)元纖維稍增粗、模糊；細(xì)胞外未見Aβ斑。與劉梅訊和孫天敏[8]、陳婷[9]報(bào)道結(jié)果一致，出現(xiàn)了輕度學(xué)習(xí)記憶損害、輕度膽堿能系統(tǒng)受損、輕度APP/Aβ代謝紊亂及輕度神經(jīng)病理學(xué)變化，即“四輕”效度變化，由此判斷MCI小鼠模型復(fù)制成功一致?！八妮p”效度變化是MCI模型的特征，因此區(qū)別了AD模型；如MCI模型組小鼠海馬勻漿Aβ42水平明顯升高，但在海馬區(qū)細(xì)胞外未發(fā)現(xiàn)Aβ斑。

本研究結(jié)果顯示，與MCI模型組比較，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組小鼠逃避潛伏期、第1次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間縮短，在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)；海馬ChAT表達(dá)水平明顯升高，而AchE、Aβ42表達(dá)水平明顯降低；HE染色，運(yùn)動(dòng)干預(yù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞密度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及神經(jīng)纖維清晰、有序，未見凋亡細(xì)胞；銀染示運(yùn)動(dòng)干預(yù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列有序，細(xì)胞神經(jīng)元纖維清晰；與既往文獻(xiàn)結(jié)果一致。提示運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)MCI模型小鼠的“四輕”效度變化，其可能機(jī)制是：運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅可以改善大腦皮質(zhì)和海馬組織的血液循環(huán)，而且還可以拮抗炎癥反應(yīng)，增加海馬結(jié)構(gòu)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生改變，從而改善海馬區(qū)病理學(xué)改變，提高M(jìn)CI模型小鼠的認(rèn)知功能[19-22]。

綜上所述，本研究采用D-gal、三氯化鋁和亞硝酸鈉三者聯(lián)合對(duì)老年小鼠給藥3周，復(fù)制了小鼠MCI“四輕”效度變化，構(gòu)建了MCI小鼠模型；并對(duì)MCI模型小鼠實(shí)施3周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，基本逆轉(zhuǎn)了MCI模型小鼠的“四輕”效度變化。這表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以明顯改善MCI模型小鼠海馬組織的病理學(xué)改變，從而提高其學(xué)習(xí)記憶能力。