姚辛敏，關(guān)慧波，于淼，王琪，周妍妍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD) 是一種進(jìn)行性認(rèn)知損害為特征的神經(jīng)變性病，起病隱匿，是老年性癡呆中最常見的原因, 占所有癡呆原因的60%～80%[1]，中醫(yī)臨床以腎虛痰濁為主證，中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為AD的基本病機(jī)為腎虛痰阻。地黃飲子是補(bǔ)腎化痰的經(jīng)典方劑，首見于《黃帝素問·宣明論方》?，F(xiàn)代臨床報(bào)道和實(shí)驗(yàn)研究均顯示其對(duì)AD治療有很好療效[2-3]。課題組前期在體實(shí)驗(yàn)與離體實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[4-8]，地黃飲對(duì)Aβ導(dǎo)致的AD動(dòng)物模型和細(xì)胞模型能夠通過血腦屏障，直接作用于大腦病變組織，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，維持細(xì)胞活力，對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用。為證實(shí)地黃飲子在雙轉(zhuǎn)染AD細(xì)胞模型中的細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司;293T(人胚腎細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫;M146L細(xì)胞由沈陽萬類生物轉(zhuǎn)染并鑒定。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量2～3 kg健康雄性大耳白家兔10只，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黑2008-004。于23 ℃、45%濕度下清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由進(jìn)食、飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

地黃飲子藥物組成熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、石斛、麥冬、五味子、石菖蒲、遠(yuǎn)志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g，生姜、大棗、薄荷各5 g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。所有飲片加10倍水浸泡2 h，煎煮1 h后濾出藥液，再加10倍水煎煮，1 h后取汁，將2次藥液混合，濃縮成每毫升含生藥1.67 g的混懸液，分裝,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

DMEM培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco;胎牛血清,美國(guó)Hyclone；PBS，中國(guó)雙螺旋；胰酶，中國(guó)碧云天；雙抗(青鏈霉素)，美國(guó)Gibco；脂質(zhì)體2000、G418,美國(guó)Invitrogen；MTT、DMSO，美國(guó)Sigma；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒，中國(guó)萬類生物；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，中國(guó)凱基。

CO2培養(yǎng)箱，上海力申；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，麥克奧迪；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化；光度計(jì)，Thermo；酶標(biāo)儀，上?？莆?；流式細(xì)胞儀，BD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)條件

CHO細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶2進(jìn)行傳代，使用由含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)；M146L細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶2進(jìn)行傳代，使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(800 μg/mL G418)培養(yǎng)。293T細(xì)胞：含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)。

2.2 中藥腦脊液的制備

體質(zhì)量2～3 kg健康雄性大耳白家兔40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白組和地黃飲子高、中、低劑量組。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定地黃飲子的給藥濃度為生藥1.67 g/mL，高、中、低劑量組分別按36 mL/kg、27 mL/kg、18 mL/kg體質(zhì)量進(jìn)行灌胃給藥，空白組灌胃給服等體積的蒸餾水。灌胃前12 h禁食不禁水，每天灌胃1次，連續(xù)3 d，末次灌胃后1 h，采用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉，抽取腦脊液0.8～1.2 mL，注入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的1.5 MLEP管中，并詳細(xì)標(biāo)記，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。使用前室溫解凍，將同組家兔的腦脊液混合，用0.22 μm微孔過濾器過濾除菌。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及腦脊液處理方法

待M146L細(xì)胞密度至90%左右，PBS清洗1次。棄PBS，加胰酶，細(xì)胞變圓后，加完全培養(yǎng)基。吹打細(xì)胞，收集至離心管，離心(800 rpm，3 min)。棄上清，將M146L細(xì)胞分為4組，分別為模型組、中高組、中中組、中低組，除去原培養(yǎng)液，分別加入10%空白腦脊液，10%地黃飲子高、中、低劑量含藥腦脊液各10 μL，再加入90 μL培養(yǎng)液。另設(shè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為空白組，加入正常培養(yǎng)液。按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后用于指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量的檢測(cè)

蛋白質(zhì)抽提：向各組細(xì)胞培養(yǎng)液中加1%Triton X-100裂解，離心(2 500 rpm，10 min)，小心吸取上清，-20 ℃保存，蛋白質(zhì)定量后應(yīng)用LDH試劑盒進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)450 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

注：標(biāo)準(zhǔn)管濃度=0.2 μmol/μL。

2.5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞OD值

收集M146L細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞以2×103/孔接種于培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)時(shí)間為1 d、2 d、3 d、4 d和5 d。到達(dá)相應(yīng)時(shí)間后，向培養(yǎng)板中加入濃度為0.2 mg/μL的MTT繼續(xù)孵育4 h～6 h。離心(1 000 rpm，10 min)，去上清，加200 μL DMSO， 室溫下?lián)u床振蕩10 min，充分溶解形成的結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在490 nm處OD值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將所有細(xì)胞經(jīng)800 rpm離心5 min后收集，并小心吸除上清后用PBS洗滌2次，再小心吸除再次800 rpm離心5 min收集的細(xì)胞上清，約殘留50 μL左右的PBS，將500 μL Binding Buffer注入到每管細(xì)胞樣品中輕輕重懸細(xì)胞。先注入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再注入5 μL Propidium Iodide混勻。室溫避光孵育15 min之后即可進(jìn)行流式檢測(cè)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 地黃飲子含藥腦脊液對(duì)M146L細(xì)胞LDH含量的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型組比較，中藥各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量均顯著降低，中低組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中中組、中高組尤為顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量比較

3.2 MTT法檢測(cè)地黃飲子含藥腦脊液對(duì)M146L細(xì)胞OD值的影響

與空白組比較，模型組OD值明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型組比較，中藥各劑量組OD值均顯著升高，中低組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中中組、中高組尤為顯著(P<0.01)。見表2。

表2 各組細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果比較

3.3 地黃飲子含藥腦脊液對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明M146L細(xì)胞能夠模擬AD細(xì)胞凋亡特征，與模型組比較，各地黃飲子腦脊液組的細(xì)胞凋亡率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，中高組和中中組優(yōu)于中低組，中高組細(xì)胞凋亡最少，地黃飲子腦脊液可顯著降低M146L細(xì)胞的凋亡率，呈劑量依賴。見表3和圖1。

表3 地黃飲子含藥腦脊液對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響

圖1 給藥后各組M146L細(xì)胞的流式細(xì)胞雙參數(shù)散點(diǎn)圖

4 討論

地黃飲子是古代名方，出自劉完素的《黃帝素問宣明論方·卷二諸證門》，在《圣濟(jì)總錄》地黃飲子的基礎(chǔ)上加薄荷而成。地黃飲子具有滋腎陰、補(bǔ)腎陽、開竅化痰的功效，適用于下元虛衰、虛陽上浮、痰濁上犯、阻塞竅道所致的喑痱證[9-11]。地黃飲子方藥主要由三類藥物組成,一類為滋陰藥，熟地黃、山茱萸補(bǔ)腎益精、滋補(bǔ)腎陰；石斛、麥門冬、五味子滋陰斂液，壯水以濟(jì)火；熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓，為滋腎填精益髓之要藥。再加薄荷以解郁、清利頭目，增強(qiáng)本方輕清上行宣竅之力。生姜、大棗和胃補(bǔ)中，調(diào)和藥性。本方即取孤陰不生，獨(dú)陽不長(zhǎng)之意，補(bǔ)陰補(bǔ)陽之藥相互配伍，以達(dá)生精填髓之目的。

脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)是參與細(xì)胞能量代謝的一種重要的酶，能催化乳酸生成丙酮酸，并產(chǎn)生ATP。正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)胞膜破裂，LDH就會(huì)從胞漿中釋放出來，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LDH含量減少，培養(yǎng)液中LDH含量增多，所以細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量可直接反映質(zhì)膜的完整性及細(xì)胞的神經(jīng)受損程度，是檢測(cè)細(xì)胞活性的重要指標(biāo)。細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量越多，就說明細(xì)胞膜越不完整、細(xì)胞受損程度越重[12]。

四噻唑藍(lán)(Methylthiazoletetrazolium，MTT)比色法被廣泛應(yīng)用于生物活性因子的活性檢測(cè)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)，具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、快速經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。MTT是一種黃色化合物，可與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)發(fā)生反應(yīng)，被還原成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞不會(huì)發(fā)生此反應(yīng)。二甲基亞砜(DMSO)可使甲瓚溶解，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定其光吸收值(OD值)。在一定范圍內(nèi)，甲瓚結(jié)晶形成的多少與活細(xì)胞數(shù)成正比，即OD值越大，藥物毒性越小，活細(xì)胞數(shù)越多。

流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。在細(xì)胞凋亡的早期階段, 胞漿膜磷脂的不對(duì)稱性喪失, 導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)層暴露于外層, 從而可以被膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)特異Annex in-V探針?biāo)鶚?biāo)記[13-14]。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是細(xì)胞凋亡特所有的, 也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。但在凋亡的早期細(xì)胞膜是完整的, 而細(xì)胞壞死時(shí)細(xì)胞膜的完整性被破壞[15-16]。碘化丙錠(PI)或7-AAD對(duì)細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞是拒染的,而對(duì)膜完整性被破壞的晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞可以染色。因此,Annex in-V結(jié)合PI 或 7-AAD進(jìn)行雙染色可以用于檢測(cè)活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。正?；罴?xì)胞不會(huì)被染色,凋亡細(xì)胞可被標(biāo)記上Annex in-V,壞死和凋亡晚期細(xì)胞可被Annexin-V和PI或7-AAD同時(shí)染色。

本實(shí)驗(yàn)選用了對(duì)各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量的檢測(cè)、MTT這兩種方法觀察了地黃飲子含藥腦脊液對(duì)M146L細(xì)胞受損程度和細(xì)胞活力的影響，并結(jié)合流式細(xì)胞檢測(cè)同時(shí)觀察地黃飲子含藥腦脊液對(duì)M146L細(xì)胞凋亡率的影響。各組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量的檢測(cè)結(jié)果提示地黃飲子含藥腦脊液具有保護(hù)細(xì)胞膜的作用。MTT結(jié)果顯示，地黃飲子含藥腦脊液給藥后細(xì)胞活力增強(qiáng)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，地黃飲子含藥腦脊液可以抑制M146L細(xì)胞凋亡。

綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明地黃飲子含藥腦脊液可以明顯減輕M146L細(xì)胞的受損程度，提高細(xì)胞活力，增加活細(xì)胞數(shù)量，抑制細(xì)胞凋亡。