馬劼旎,吳 松,李 丹，李方文卉，韓永麗,陳 松，趙 敏

(湖北中醫(yī)藥大學,湖北 武漢 430061)

心肌缺血(Myocardial ischemia，MI)是因冠狀動脈持續(xù)性缺血缺氧引起，可導致心肌梗死或心力衰竭等損傷，該病發(fā)病率和病死率呈上升趨勢。重建冠狀動脈血流是該病常規(guī)的臨床治療手段，但恢復心肌供血及供氧的同時，心肌組織損傷會加重，稱為缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia - reperfusion injury，MIRI),在治療心肌缺血中減輕缺血再灌注損傷成為關鍵因素。針灸預處理作為針灸治未病的手段之一，具有良好的預治作用，臨床研究表明，針刺預處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷，對其治療具有一定效果，但其機制尚未完全明確[1-2]。在各種急性心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia - reperfusion injury，MIRI)大鼠模型中，以在體冠狀動脈結扎最為常用，左心功能指標能較好反映MIRI對心臟機能所造成的影響和心室重構的情況[3-4]。亦有研究表明胰島素抵抗是多種代謝疾病的共同病理表現(xiàn)，其參與了MIRI對心肌損傷的全過程[5]。本實驗通過觀察左心室心功能指標、大鼠血漿內(nèi)β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素的含量及心肌細胞結構，對電針預處理“內(nèi)關”對MIRI的保護作用及時間規(guī)律進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗儀器 ST-360型酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司);ALC-V8S小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司);BL-420系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);HANS-200型電針治療儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司);TGL-10B系列臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.1.2 主要試劑 β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素試劑盒購自北京萊博特利生物醫(yī)學科技有限公司。

1.2 實驗動物及分組

1.2.1 實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠60只,體質量180～220 g，購于湖北省醫(yī)學科學研究院實驗動物中心[動物使用許可證號：SYXK(鄂)2012-0067]。購入后適應性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學SPF級標準動物房，飼養(yǎng)條件：動物房溫度為20～25℃，相對濕度(50±10)%，自由進食進水。動物實驗在湖北中醫(yī)藥大學科研中心進行。

1.2.2 實驗分組及處理方法 大鼠適應性喂養(yǎng)1周開始實驗，采用隨機數(shù)字表法，將60只大鼠隨機分為6組：對照組(S組)、模型組(M 組)、電針預處理0.5 h組(EA1組)、電針預處理1 h組(EA2組)、電針預處理2 h組(EA3組)和電針預處理3 h組(EA4組)。對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，開胸后暴露心臟不做其他處理；模型組：采用左前降支冠狀動脈結扎術，開胸后缺血20 min，再灌注40 min;各電針刺預處理組：分別于造模前0.5 h、1 h、2 h和3 h選取大鼠雙側“內(nèi)關”穴進行電針，造模方法同模型組。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立

1.3.1 心肌缺血模型制備 將大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉，把大鼠固定于鼠臺，將其四肢連接電極，心電導連線按右前肢(綠) 、右后肢(黑)和左前肢(紅)相連，進行心電監(jiān)測[6-7]。剪開其頸部皮膚并暴露氣管，在氣管切口插入導管，使用呼吸機輔助呼吸。心前區(qū)剪毛并消毒，在左胸骨第3、4肋間暴露心臟，結扎前降支冠狀動脈，打活結造成缺血模型，并在缺血20 min后，行左冠狀動脈缺血再灌注術。

1.3.2 制備成功標志 心電監(jiān)測中ST段明顯抬高為缺血標志；再灌注時心電圖抬高的ST段下降，且局部有反應性充血的現(xiàn)象，即為造模成功[8]。

1.4 電針預處理方法

除對照組與模型組外，EA1組、EA2組、EA3組和EA4組針刺預處理時間分別為：造模前0.5 h、1 h、2 h和3 h。方法為上述4組大鼠置于鼠臺，參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》[9]取穴，在前肢內(nèi)側離腕關節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間取雙側內(nèi)關，用0.30 mm×15 mm毫針針刺雙側穴位，針刺深度約5 mm，接HANS-200電針治療儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強度為1 mA，電針30 min。

1.5 指標檢測

1.5.1 左心室心功能指標的測定 接入呼吸機，分離大鼠頸總動脈，對其頸外靜脈和頸動脈進行插管，連接BL-420系統(tǒng)，待造模成功后，收集各組舒張末期壓力(end-diastolic pressure,LVEDP)、左室收縮期平均壓(left ventricular systolic mean presure,LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.5.2 血漿β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素的測定 MIRI造模成功后，用10%水合氯醛進行麻醉，取2 mL腹主動脈血，置于肝素抗凝管中，常溫下在離心機3 000 r/min離心15 min取得血清，隨后將血清進行分離，并按照試劑盒說明書上進行操作。

1.5.3 心肌組織形態(tài)學觀察 將大鼠心肌組織置于緩沖液中進行漂洗，使其固定3 h，隨后按照脫水、包埋、固化和切片的步驟，切片厚度為50～100 nm,使用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在透射電鏡下觀察心肌細胞結構。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 實驗結果

2.1 各組大鼠舒張末期壓力、左室收縮期平均壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率和左心室內(nèi)壓最大下降速率比較

與S組相比較，M組、EA1組、EA2組、EA3組和EA4組的LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EA1組、EA2組、EA3組和EA4組與M組比較，LVEDP顯著降低，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax水平有所上升(P<0.05)。尤其是EA3組、EA4組對于LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的影響明顯優(yōu)于EA1組和EA2組(P<0.05)，EA1組和EA2組比較，各項指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，EA3組和EA4組比較，各項指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠 LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax比較

2.2 各組大鼠β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素比較

與S組相比較，M組、EA1組、EA2組、EA3組和EA4組的β-EP、胰島素、C肽和抵抗素的含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EA1組、EA2 組、EA3組和EA4組與M組比較，能顯著下調β-EP、胰島素、C肽和抵抗素的表達(P<0.05)。尤其是EA3組、EA4組對于β-EP、胰島素、C肽和抵抗素含量的影響明顯優(yōu)于EA1組和EA2組(P<0.05)。EA1組和EA2組對于β-EP、胰島素、C肽和抵抗素含量的影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，EA3組和EA4組比較β-EP、胰島素、C肽和抵抗素含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠β-EP、胰島素、C肽和抵抗素比較

2.3 大鼠心肌細胞形態(tài)學觀察(電鏡)

見圖1。S組大鼠心肌肌纖維組織排列較為規(guī)整，心肌細胞胞質充實，線粒體數(shù)量為正常值，未見明顯異常；M組大鼠心肌細胞結構較為模糊，心肌肌纖維溶解，線粒體腫大，其肌漿網(wǎng)可見明顯擴張和腫脹；EA1組、EA2組、EA3組和EA4組的心肌肌纖維排列較為整齊，線粒體有部分腫大，心肌細胞腫脹減少，其中EA3組和EA4組的心肌纖維排列更為齊整，線粒體結構完整，自噬空泡較少，溶酶體較多。

3 討論

心肌缺血后會出現(xiàn)左心室重構，并逐步發(fā)展為心力衰竭的慢性階段，同時伴有心功能下降和心室擴張[10]。左室舒張末期壓力(end-diastolic pressure,LVEDP)增大表明舒張末期耗能增加，左室收縮期平均壓(Left ventricular systolic mean presure,LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)則反映心肌的收縮能力，四者相結合能較好地反映心室重構的情況[4]。有研究表明，導致心肌缺血患者心功能損傷的因素眾多，其中由MIRI引起的心肌胰島素抵抗可能是導致心功能損傷及患者并發(fā)癥發(fā)生率和病死率增加的重要原因之一，因此降低甚至糾正心肌胰島素抵抗可能對改善患者預后具有重要意義[11]。血清C肽水平可反映胰島細胞貯備功能，其作為有效評估胰島功能的方法，在一定程度上可反映胰島素抵抗的情況[12]。β-內(nèi)啡肽(β-endorphin，β-EP)屬于內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)，該物質在腦神經(jīng)系統(tǒng)中大量存在，在急性冠脈綜合征發(fā)生、發(fā)展的過程中起重要作用，能夠通過調節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)來參與心血管活動，有研究發(fā)現(xiàn)中樞與外周β-內(nèi)啡肽對在體大鼠MIRI有保護作用[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在休息時β-內(nèi)啡肽可影響胰島素和胰高血糖素水平，從而可能影響運動過程中葡萄糖的作用，并且血清C肽在運動過程中水平下降[14]。因此本實驗通過對β-內(nèi)啡肽、胰島素、C肽和抵抗素含量的測定，來探究胰島素抵抗機制作用及影響。

心肌缺血屬于傳統(tǒng)醫(yī)學中“胸痹心痛”的范疇，臨床以胸痛、胸悶、短氣、疲乏無力與心律失常等為主要表現(xiàn)。本實驗根據(jù)中醫(yī)“治未病”的理論，采用電針“內(nèi)關”預處理的方法防治心肌缺血。針刺預處理蘊含著針灸“治未病”的思想理論，針灸用于預防疾病稱為“逆針灸”，是我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治未病的主要手段之一?！端貑枴ご虩嵴摗分杏涊d：“病雖未發(fā)，見赤色者刺之，名曰治未病。”治未病是指在疾病未發(fā)生之前進行防治，其理念與現(xiàn)代預防醫(yī)學有共通之處，即預防疾病的發(fā)生優(yōu)先度高于發(fā)病后治療，從而降低疾病的發(fā)病率，提高國民的健康水平?！皟?nèi)關”穴為手厥陰心包經(jīng)之絡穴，通于陰維脈，對于心胸部疾病有良好療效?！夺樉拇蟪伞ぶ尾∫ā吩唬骸皟?nèi)關：主氣塊，及脅痛，勞熱，瘧疾，心胸痛。”且《針灸大成·八法交會八穴歌》中記載：“公孫沖脈胃心胸，內(nèi)關陰維下總同”，也提到內(nèi)關為治療心系疾病的重要穴位之一。

本實驗結果表明,與模型組比較，電針“內(nèi)關”預處理可通過降低LVEDP，升高LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax水平，改善左心功能和影響心室重構；同時電針干預能顯著下調β-EP、胰島素、C肽和抵抗素的含量，有效調控胰島素抵抗相關因子，減少心肌組織的損傷。透射電鏡結果提示，模型組大鼠心肌細胞結構較為模糊，心肌肌纖維溶解，線粒體腫大，其肌漿網(wǎng)可見明顯擴張和腫脹；電針預處理組的心肌肌纖維排列較為整齊，線粒體有部分腫大，心肌細胞腫脹減少，其中EA3組和EA4組的心肌纖維排列更為齊整，線粒體結構完整，自噬空泡較少，溶酶體較多，說明電針預處理可以減輕心肌組織的損傷，保持其結構和功能的完整性。其中，電針預處理2 h組和電針預處理3 h組對各項指標的改善情況優(yōu)于電針預處理0.5 h組和電針預處理1 h組，該結論提示不同時間點對心肌組織的保護效應具有一定差異。有研究表明針刺預處理內(nèi)關穴3～5 d均能有效降低心肌梗死面積，其中以4 d為佳，但預處理超過3 d后電針的保護作用進入平臺期[14]。本實驗電針預處理時間點的選擇為造模前0.5～3 h,可較好發(fā)揮針刺即時效應，避免平臺期對保護效應的影響，但由于樣本量較小，針刺預處理時間點的選擇仍需進一步探究。本實驗結果證實了電針“內(nèi)關”預處理能通過調控應激反應及胰島素抵抗相關因子來保護受損心肌組織，降低 MIRI 對心功能的損害，且預處理的時間點選擇對心肌的保護作用有差異性。本研究筆者從胰島素抵抗的角度討論了電針預處理對心肌缺血保護作用的可能機制，但由于樣本量和其他條件的限制仍需進行深入研究，為臨床心肌缺血的治療提供思路。