張雨墨,李曉寧,付 豪,教傳旭,梁雪松

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán))， 廣東 深圳 518133

脊髓損傷(SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)由直接或間接暴力損傷之后，表現(xiàn)出局部出血、水腫、壞死或神經(jīng)元損傷，進(jìn)而使神經(jīng)系統(tǒng)功能遭到不可逆轉(zhuǎn)的破壞，由于發(fā)病急驟，致殘率和致死率高，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成極大的影響及較重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[1-4]。我國每100萬人中有37人罹患該病，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)[5]。SCI會(huì)導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能缺損并帶來許多并發(fā)癥，如嚴(yán)重的肌肉麻痹和下肢功能喪失等肢體運(yùn)動(dòng)障礙、感覺障礙、二便失禁、營養(yǎng)不良以及自主神經(jīng)功能障礙甚至引發(fā)抑郁癥等心理疾病[6-7]。還有外國學(xué)者認(rèn)為SCI患者會(huì)并發(fā)輕度至中度睡眠呼吸障礙病[8]。脊髓損傷分為由外力、創(chuàng)傷所致的原發(fā)性損傷和由血管損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激引起的繼發(fā)性損傷[9]。而后者導(dǎo)致脊髓組織發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)性增生瘢痕和生成的壞死腔才是阻礙脊髓損傷后再生功能的首要原因[10]。目前研究最多的一種炎癥小體是NLRP3炎癥小體，作為小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和Caspase-1組裝而成[11-12]。NLRP3是NOD樣受體家族的核心成員，同時(shí)也是NLRP3炎癥小體的受體蛋白。P2X7R是一種細(xì)胞外ATP門控型離子通道，在神經(jīng)系統(tǒng)中，P2X7R廣泛分布于小膠質(zhì)細(xì)胞、施旺細(xì)胞和星狀細(xì)胞，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路等許多細(xì)胞生理病理過程。當(dāng)脊髓損傷發(fā)生時(shí)，脊髓組織產(chǎn)生大量的ATP作為內(nèi)源性信號(hào)使P2X7R表達(dá)增高，NLPR3炎性小體活化，Caspase-1激活，催化pro-IL-1β、pro-IL-18蛋白形成并釋放炎癥因子，如IL-1和IL-18，從而進(jìn)一步加重脊髓組織炎性損傷[13-15]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)夾脊電針能通過抑制SCI大鼠NLRP3炎性小體的活化，以緩解脊髓損傷后的炎性損傷。本研究通過建立SCI大鼠模型，引入siRNA 干擾 P2X7的表達(dá)來探究脊髓損傷之后應(yīng)用夾脊電針調(diào)控P2X7R/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的機(jī)制，通過BBB評(píng)分評(píng)估其運(yùn)動(dòng)功能，對(duì)比組內(nèi)及組間各大鼠脊髓中的NLRP3蛋白、NLRP3 mRNA及NLRP3/OX42共表達(dá)的情況，擬為臨床應(yīng)用夾脊電針治療SCI給出可信的研究數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)研究選用SPF級(jí)雌性SD大鼠120只[遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001]，體質(zhì)量(220±10)g。各組鼠于實(shí)驗(yàn)前在室溫(23±2)℃、通風(fēng)良好和相對(duì)濕度45%～70%環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)1周，明暗光每12 h交替循環(huán)。實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格遵照國際最新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南，給予大鼠充分關(guān)懷，合理對(duì)大鼠進(jìn)行處置。

1.2 主要試劑與設(shè)備儀器

1.2.1 主要試劑 二甲苯(10023418，中國)；無水乙醇(10009228，中國)；蘇木素-伊紅試劑盒(WLA051a，中國Wanleibio)；NLRP3 (Rb)(NBP2-12446，美國novusbio)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(# 31460，美國thermofisher)；OX42 (Ms)(ab1211，英國abcam)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(WLA004，中國wanleibio)；山羊血清SL038(中國Solarbio)；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(綠光)A5608(中國Beyotime)；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(紅光)A0516(中國Beyotime)；一抗二抗去除液(WLA007，中國wanleibio)；DAPI(C1002，中國Beyotime)；Western洗滌液(WLA025，中國wanleibio)；Powder瓊脂糖(111860，西班牙Biowest);多功能DNA純化回收試劑盒(DP1721，北京BioTeke)；質(zhì)粒大量制備試劑盒(DP2802，北京BioTeke)。

1.2.2 主要設(shè)備儀器 KWD-808-Ⅱ型針灸治療儀(英迪)；H-2050R超速冷凍離心機(jī)(湖南長沙湘儀)；RM2235石蠟切片機(jī)(德國Leica)；BX53顯微鏡、DP73顯微鏡拍照系統(tǒng)(日本OLUMPUS)；WD-9405B水平搖床、WD-9413B凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)；Proline微量移液器(蘇州BIOHIT);Exicycler 96熒光定量PCR儀(韓國BIOER)；NANO 2000紫外分光光度計(jì)(美國Thermo)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

將120只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組、夾脊電針組、P2X7R干擾組和干擾對(duì)照組，每組根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)分為1 d、3 d、7 d和21 d共4個(gè)亞組，每個(gè)亞組各6只。分組后采用染色法標(biāo)記各鼠。選擇BBB 評(píng)分為1～3分的大鼠入組。

2.2 動(dòng)物處理方式

2.2.1 假手術(shù)組 切除相應(yīng)的椎板暴露脊髓后不予撞擊，隨后即縫合傷口，常規(guī)飼養(yǎng)，同其他各組大鼠一同捆綁，不予其他處置。

2.2.2 模型組 模型制備成功后，正常捆綁，常規(guī)飼養(yǎng)，不予其他處置。

2.2.3 夾脊電針組 造模成功3 h待大鼠蘇醒后，給予夾脊電針治療。取T9、T11節(jié)段夾脊穴，受術(shù)部位用75%濃度酒精常規(guī)消毒后，用華佗牌0.35 mm×13 mm針灸針直刺4～5 mm至針尖觸及椎扳。按照上正下負(fù)的原則，將電針治療儀正負(fù)兩端分別接在同側(cè)兩針針柄，計(jì)時(shí)器調(diào)至30 min，輸出頻率為100 Hz，輸出電流調(diào)至1～2 mA以大鼠背部肌肉輕度顫動(dòng)且大鼠不強(qiáng)烈掙扎為度。每次治療時(shí)間為30 min，每日1次，至療程結(jié)束為止。

2.2.4 P2X7R干擾組 造模成功后，用明膠海綿在大鼠脊髓傷口處按壓并止血，直到手術(shù)區(qū)域沒有明顯的出血為止。然后使用10 μL微量注射器抽取8 μL滴度為107TU/mL P2X7R干擾慢病毒懸浮液，在損傷部位頭部和尾部，距離損傷邊緣2 mm，背部中央靜脈兩側(cè)各1 mm處各取一個(gè)注射點(diǎn)，傾斜45°進(jìn)針，進(jìn)針深度約1.5 mm，各注射點(diǎn)分別注射2 μL病毒懸液，注射后針頭停留3 min，最后緩慢退出針頭。

2.2.5 干擾對(duì)照組 同上述方法注射陰性對(duì)照慢病毒。

2.3 造模方法

本實(shí)驗(yàn)采用改良Allen’s打擊法制作SCI大鼠模型。術(shù)前12 h對(duì)大鼠禁食，正常喂水，準(zhǔn)備好相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑及器具，隨機(jī)選取SD大鼠，稱重后按照3.5 mL/kg配比，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。待大鼠完全麻醉后，用俯臥位將其固定，按肋骨順序確定T10脊柱位置并以T10棘突為中心對(duì)背部皮膚局部脫毛，常規(guī)消毒皮膚，鋪無菌手術(shù)巾，用手術(shù)刀以T10棘突為中心切開3 cm長的切口，逐層切開至觸及椎板停止。隨后用組織鉗將皮膚、筋膜和肌肉逐層鈍性剝離，露出T9-11棘突，用小手術(shù)剪將棘突切除，暴露椎板，接著用小咬骨鉗咬掉椎板，避免損傷硬腦膜并完全暴露脊髓組織，至此準(zhǔn)備階段工作完成。然后將玻璃管垂直放置在硬腦膜上方，并使用消毒后的5 g砝碼沿玻璃管自由下落，擊中硬脊膜從而造成該節(jié)段脊髓損傷，用生理鹽水仔細(xì)沖洗傷口后作縫合術(shù)。術(shù)后補(bǔ)液，腹腔注射5 mL生理鹽水，每12 h協(xié)助大鼠排尿1次，維持1～2周，直至大鼠恢復(fù)反射性排尿。造模成功的標(biāo)志是大鼠身體抖動(dòng),雙下肢迅速回縮, 尾巴一過性痙攣，受損部位脊髓組織顏色加深出現(xiàn)瘀血[16-19]。最后當(dāng)大鼠蘇醒后，由3名實(shí)驗(yàn)人員對(duì)大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分，選取評(píng)分1～3分者納入研究。評(píng)分內(nèi)容如表1。

表1 大鼠BBB評(píng)分

2.4 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.4.1 大鼠行為學(xué)觀察 BBB評(píng)分量表是目前對(duì)SCI大鼠行為學(xué)評(píng)分的量表之一，具有較強(qiáng)的客觀性和有效性[20-21]。各組大鼠分別于模型建立后第1天、3天、7天和21天進(jìn)行評(píng)分，觀察大鼠的雙后肢、髖、膝和足關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)情況，每次觀察1 min，取2次評(píng)分的平均值作為BBB評(píng)分的結(jié)果。BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2。

表2 BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.4.2 NLRP3蛋白、NLRP3 mRNA及NLRP3/OX42共表達(dá) 各組于模型建立后分別在第1天、3天、7天和21天稱重，給予10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹膜內(nèi)麻醉。完全麻醉后將大鼠斷頭處死，在冰盒上迅速取出長約4 cm的損傷節(jié)段脊髓組織，放置于4%多聚甲醛緩沖液中固定，4℃恒溫儲(chǔ)存以備使用。用Western blot法檢測(cè)NLRP3蛋白的表達(dá)，用Realtime-PCR檢測(cè)各組大鼠脊髓組織NLRP3 mRNA的表達(dá)，用免疫熒光雙染法觀察NLRP3與OX42共定位表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠治療前后BBB評(píng)分比較

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均為滿分21分，表示無后肢運(yùn)動(dòng)障礙。各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠BBB評(píng)分較假手術(shù)組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后3 d、7 d和21 d夾脊電針組大鼠BBB評(píng)分較模型組大鼠升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3；隨著時(shí)間推移，假手術(shù)組分?jǐn)?shù)維持不變，夾脊電針組與模型組大鼠BBB評(píng)分隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，且夾脊電針組上升幅度高于模型組，說明夾脊電針能顯著改善其運(yùn)動(dòng)功能，療效隨療程推進(jìn)越發(fā)明顯。

表3 各組大鼠治療前后BBB評(píng)分

3.2 各組Western blot檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)

假手術(shù)組NLRP3蛋白表達(dá)在所有時(shí)間點(diǎn)均維持在較小且穩(wěn)定的低水平。在術(shù)后3 d、7 d和21 d時(shí)，模型組NLRP3蛋白表達(dá)較假手術(shù)組升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；夾脊電針組、P2X7R干擾組NLRP3蛋白表達(dá)均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);干擾對(duì)照組NLRP3蛋白較P2X7R干擾組表達(dá)量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨療程推進(jìn)，模型組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)在1 d、3 d和7 d呈上升趨勢(shì)，7 d時(shí)達(dá)到峰值，21 d出現(xiàn)下降趨勢(shì)；夾脊電針組NLRP3在1 d、3 d和7 d表達(dá)增加，21 d出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均低于模型組。見表4。

表4 各組大鼠脊髓組織NLRP3相對(duì)表達(dá)量變化

3.3 各組Realtime-PCR檢測(cè)NLRP3 mRNA表達(dá)

各時(shí)間點(diǎn)模型組NLRP3 mRNA較假手術(shù)組均升高顯著(P<0.05);夾脊電針治療后在3 d、7 d和21 d時(shí)NLRP3 mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05);在3 d、7 d和21 d時(shí)，P2X7R干擾組NLRP3 mRNA表達(dá)水平低于干擾對(duì)照組和模型組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠脊髓組織NLRP3mRNA表達(dá)水平變化

3.4 免疫熒光雙染法檢測(cè)NLRP3與OX42共定位情況

NLRP3和OX42與免疫熒光共定位：于熒光顯微鏡下可見紅色熒光(NLRP3陽性)、綠色熒光(OX42陽性)、藍(lán)色熒光(細(xì)胞核)及橙色(NLRP3陽性和OX42陽性雙染)。模型組NLRP3與OX42共定位陽性在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均明顯多于假手術(shù)組，在3 d、7 d和21 d時(shí)顯著多于夾脊電針組和P2X7R干擾組。見圖1～4。

圖1 各組免疫熒光雙染圖(1 d)

圖2 各組免疫熒光雙染圖(3 d)

圖3 各組免疫熒光雙染圖(7 d)

圖4 各組免疫熒光雙染圖(21 d)

4 討論

脊髓損傷在中醫(yī)上無與之完全對(duì)應(yīng)的病名，結(jié)合臨床表現(xiàn)可將其歸屬為“痿證”范疇，病機(jī)多為督脈受損之后，氣血瘀滯發(fā)而痿痹?！鹅`樞·本輸》云：“痿厥者，張而刺之，可令立快也?！比A佗夾脊穴位于督脈之旁，針刺時(shí)針尖略向脊椎傾斜進(jìn)針，針尖附近有脊神經(jīng)后支分布，針刺該區(qū)域可以調(diào)節(jié)神經(jīng)根興奮性，配合電針以改善局部血液循環(huán)及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

脊髓損傷后，繼發(fā)的組織水腫、細(xì)胞凋亡及一系列炎癥風(fēng)暴造成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的抑制性微環(huán)境會(huì)限制神經(jīng)元新生，這是影響神經(jīng)再生的一個(gè)障礙[22]。而炎性小體在炎癥風(fēng)暴的進(jìn)程中扮演著十分重要的角色，其中NLPRP3炎性小體作為不可或缺的一員，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要，脊髓損傷后的炎癥風(fēng)暴主要依靠活化的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，OX42是小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，依靠免疫熒光雙染技術(shù)將NLRP3蛋白和OX42標(biāo)記，可以通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察NLRP3蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，即NLRP3與OX42共定位的情況。胞外的ATP可以激活P2X7受體(P2X7R)，從而使NLRP3炎性小體活化[23]，導(dǎo)致P2X7R調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，如IL-1β、腫瘤壞死因子α和前列腺素E2[24]，繼而放大局部炎性損傷，對(duì)組織造成難以逆轉(zhuǎn)的損害。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒感染能力強(qiáng)、整合能力強(qiáng)、免疫反應(yīng)小和載體容量大的特點(diǎn)，將其引入從而干擾P2X7R/NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及釋放。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了脊髓損傷后微環(huán)境和脊髓組織小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)會(huì)升高，夾脊電針和P2X7R siRNA干擾病毒均可抑制NLRP3蛋白的表達(dá)及干擾P2X7R的激活，以抑制NLRP3 mRNA的表達(dá)，減輕由NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而改善SCI大鼠脊髓組織炎性損傷。所以筆者認(rèn)為夾脊電針具有和慢病毒siRNA相似的作用，可以調(diào)控P2X7R/NLRP3通路相關(guān)蛋白在微環(huán)境及小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。

綜上所述，夾脊電針能通過調(diào)控P2X7R/NLRP3通路降低SCI大鼠脊髓組織NLRP3蛋白、NLRP3 mRNA以及NLRP3與OX42共定位的表達(dá)水平，減輕脊髓損傷大鼠炎癥反應(yīng)，改善脊髓損傷大鼠運(yùn)功功能。