周鈺點(diǎn)，王雅媛，楊姝瑞，梁鳳霞

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061)

肥胖是由多種原因?qū)е碌拇x紊亂，近年來肥胖人群數(shù)量逐年增長(zhǎng)，這多和人們的生活水平提高及生活方式的改變有關(guān)。肥胖作為多種疾病的病理基礎(chǔ)，已經(jīng)成為全球健康的重大挑戰(zhàn)[1]。SIRT1(Silent Mating Type Information Regulation 2 Homolog 1)屬于Ⅲ類組蛋白去乙?；?Histone Deacetylase，HDAC)，是NAD+依賴的去乙?；?，最初研究認(rèn)為它主要參與延長(zhǎng)生物壽命和限制熱量攝入等生理功能。后來的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明 SIRT1 與肥胖的多個(gè)病理環(huán)節(jié)密切相關(guān)[2]，前期研究證實(shí)，電針干預(yù)肥胖大鼠可改善其中樞和外周的炎癥狀態(tài)[3-4]，因此筆者在此基礎(chǔ)上，使用SIRT1特異性抑制劑聯(lián)合“標(biāo)本配穴”電針干預(yù)肥胖大鼠，觀察電針對(duì)肥胖大鼠血清和肝臟IL-6、TNF-α的影響，探討電針治療肥胖的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

微型高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet，型號(hào)：C2500-R-230V)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，型號(hào)：ICV-450)；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；SIRT1抑制劑Nicotinamide(Meilunbio，貨號(hào)：MB1661)；大鼠白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0015c)；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：E-EL-R2856c)；IL-6(bioss，貨號(hào)：bs-0782R)、TNF-α抗體(abcam，貨號(hào)：ab66579)；韓式電針治療儀( HANS-LH202H型，南京濟(jì)生醫(yī)療科技醫(yī)療有限公司)；中研太和牌一次性無菌針灸針(0.30 mm×15 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 動(dòng)物模型與分組

8周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠70只，體質(zhì)量為(200±20)g(由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：42000600033568)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)挑選10只大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)(3.8 kcal/g ，含 70%碳水化合物, 20% 蛋白質(zhì),10%脂肪)，8周后隨機(jī)抽取6只作為正常組。其余大鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)(5.4 kcal/g，含38.5%碳水化合物,15%蛋白質(zhì),46.5%脂肪)，8周后采用隨機(jī)數(shù)字表法從造模成功的大鼠中抽取24只，分成模型組、電針組、針加抑組和抑制劑組，每組各6只。

1.3 模型評(píng)價(jià)

測(cè)定大鼠體質(zhì)量、肛鼻長(zhǎng)，計(jì)算Lee’s指數(shù)[Lee's Index=(W×1 000)1/3/L，W為體質(zhì)量(g)，L為肛鼻長(zhǎng)(cm),LI的大小反映大鼠體脂的含量],以高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠體質(zhì)量超過標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)的大鼠體質(zhì)量的20%作為肥胖大鼠模型[5]。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 正常組 標(biāo)準(zhǔn)飲食，不予干預(yù)。

1.4.2 模型組 高脂飲食，不予干預(yù)。

1.4.3 電針組 選取中脘、關(guān)元、足三里與豐隆。使用0.30 mm×15 mm一次性針灸針，足三里、豐隆穴均直刺3～5 mm，關(guān)元穴向劍突方向、中脘穴向恥骨聯(lián)合方向斜刺 3～5 mm。采用HANSLH202H型電針治療儀，2 Hz，1 mA，連續(xù)波。關(guān)元和中脘連接同一輸出電極，同側(cè)足三里和豐隆連接另一個(gè)輸出的兩個(gè)電極。每日留針10 min，每周治療3次，共治療8周。

1.4.4 針加抑組 給予SIRT1特異性抑制劑Sirtinol(1 mg/kg，尾靜脈注射給藥)[6]，并實(shí)施與電針組相同的電針治療，每周治療3次，共8周。

1.4.5 抑制劑組 給予SIRT1特異性抑制劑Sirtinol(1 mg/kg，尾靜脈注射給藥)，每周注射3次，共8周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 體質(zhì)量、Lee’s指數(shù) 在干預(yù)前和干預(yù)后測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量、肛鼻長(zhǎng)并依據(jù)前述公式計(jì)算Lee’s指數(shù)。

1.5.2 血清IL-6、TNF-α含量檢測(cè) 大鼠處死前心尖取血，使用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α和IL-6含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 Western blot檢測(cè)肝臟組織IL-6和TNF-α蛋白表達(dá) 取大鼠肝臟組織100 mg并加入1 mL裂解液，碾磨至完全裂解后，4℃離心(12 000 r/min，15 min)。取上清作為蛋白濃度測(cè)定,配制分離膠與濃縮膠，然后按順序加樣，電泳90～120 min，之后采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜，使用對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育 1 h。使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，以目的蛋白與內(nèi)參光密度比值比較各組樣品的蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較

干預(yù)前，與正常組相比，模型組、電針組、針加抑組和抑制劑組體質(zhì)量均顯著升高(P<0.01),且4組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示造模成功。干預(yù)8周后，與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，電針組、針加抑組大鼠體質(zhì)量在電針干預(yù)后顯著降低(P<0.01)；與電針組相比，針加抑組大鼠體質(zhì)量較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與抑制劑組相比，針加抑組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠Lee’s指數(shù)比較

在干預(yù)前，與正常組相比，其余各組大鼠的Lee’s指數(shù)均顯著升高(P<0.01)；干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠Lee’s指數(shù)均明顯高于正常組大鼠(P<0.01)，提示高脂飲食能誘發(fā)并維持大鼠的肥胖狀態(tài)。與模型組相比，電針組和針加抑組大鼠Lee’s指數(shù)降低(P<0.01)；與抑制劑組相比，針加抑組大鼠Lee’s指數(shù)降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)前后Lee’s指數(shù)變化

2.3 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量比較

與正常組相比，其余各組大鼠的血清IL-6和TNF-α含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組和針加抑組大鼠在電針干預(yù)后其血清TNF-α、IL-6含量均明顯下降(P<0.05)；與電針組相比，針加抑組和抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-6含量有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與抑制劑組相比，針加抑組大鼠血清IL-6和TNF-α含量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較

2.4 各組大鼠肝臟組織IL-6和TNF-α蛋白水平比較

與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織中IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，用電針干預(yù)過后的電針組和針加抑組大鼠肝臟組織中IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)。與抑制劑組相比，針加抑組大鼠肝臟組織中IL-6蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)，TNF-α蛋白表達(dá)量有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組大鼠肝臟組織IL-6和TNF-α蛋白水平比較

表4 各組肝臟組織IL-6、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為肥胖多屬于“痰濕”“脾虛”“胃火”等范疇。《靈樞·逆順肥瘦》中記載：“此肥人也，廣肩腋，項(xiàng)肉薄，厚皮而黑色，唇臨臨然，其血黑以濁，其氣澀以遲?！薄额惤?jīng)》曰：“……肥貴人,則高粱之疾也……肥貴之人,每多厚味,夫肥者令人熱中，甘者令人中滿，熱蓄于內(nèi)，多傷其陰，故為此諸病?！闭f明肥胖的發(fā)生與飲食習(xí)慣相關(guān),人體正常的代謝依賴于脾胃的運(yùn)化及腸道的吸收。國(guó)內(nèi)外研究表明，電針能夠從控制進(jìn)食、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、緩解炎癥、抑制交感神經(jīng)興奮性和調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路等多個(gè)環(huán)節(jié)影響和治療肥胖[7-8]。肥胖被認(rèn)為是一種慢性低水平的系統(tǒng)性炎癥，IL-6和TNF-α是已被證實(shí)的和肥胖相關(guān)的炎癥因子[9-10]。研究表明，肥胖者血液循環(huán)中的IL-6和TNF-α均是升高的，IL-6在肥胖狀態(tài)下高度表達(dá)，伴隨肥胖的加重，巨噬細(xì)胞的數(shù)量和IL-6的表達(dá)也隨之增高[11]。肝臟是脂質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所，有研究發(fā)現(xiàn)，激活小鼠肝臟細(xì)胞炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，是引起肥胖和胰島素抵抗的關(guān)鍵因素之一[12]。

SIRT1廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的肝臟、脂肪、肌肉和下丘腦中，與肥胖的多個(gè)病理環(huán)節(jié)相關(guān)[13],現(xiàn)有研究和本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，電針可以激活下丘腦SIRT1基因和蛋白的表達(dá)，抑制下游的NF-κB炎癥能量信號(hào)通路，同時(shí)促進(jìn)下游抑食欲肽POMC的表達(dá)，從而達(dá)到抑制攝食、改善肥胖的作用。針灸發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵因素在于腧穴配伍，中醫(yī)理論認(rèn)為肥胖的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本課題組在中醫(yī)理論指導(dǎo)下提出了針灸“標(biāo)本配穴”法[16]，以正氣為本，選用關(guān)元、足三里固護(hù)先天的腎氣與后天的脾胃之氣，選用中脘與豐隆祛痰濕之邪,這些穴位也是近年多次被報(bào)道的用于治療肥胖相關(guān)疾病的常用效穴[17]。肥胖和胰島素抵抗作為糖尿病的前期狀態(tài)和病理基礎(chǔ)，盡早對(duì)其進(jìn)行干預(yù)符合針灸治未病理論。目前藥物治療肥胖存在較大的副作用，而針灸作為一種綠色診療方案，能夠避免服用激素類藥物帶來的不良反應(yīng)，值得臨床推廣。

本實(shí)驗(yàn)在標(biāo)本配穴電針的基礎(chǔ)上，加用SIRT1特異性抑制劑阻斷SIRT1的效應(yīng)。研究結(jié)果表明，與正常組相比，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠的體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、血清和肝臟IL-6及TNF-α水平均顯著升高，這提示肥胖的發(fā)生發(fā)展可能與炎癥因子的釋放有關(guān)。經(jīng)過電針的干預(yù)，電針組和針加抑組大鼠的體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、血清和肝臟TNF-α、IL-6水平較模型組相比均明顯降低；與單純使用SIRT1抑制劑干預(yù)的大鼠相比，針加抑組大鼠的血清和肝臟TNF-α、IL-6水平均明顯下降。這提示電針可以改善肥胖狀態(tài)，抑制炎性反應(yīng)，同時(shí)電針可以逆轉(zhuǎn)SIRT1抑制劑的抑制效應(yīng)，其機(jī)制可能是通過激活STRT1通路的抗炎作用實(shí)現(xiàn)的。