劉曉芳，劉瓊，黃云祥，鐘引鳳，何慶華，李燕萍，涂追，付金衡*

（1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047；3.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；4.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330031）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種慢性感染的病原菌，世界衛(wèi)生組織將其定為Ⅰ類致癌原[1]，細(xì)胞空泡毒素（Vacuolating cytotoxin，Vac A）是Hp產(chǎn)生并經(jīng)自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑分泌到胞外的蛋白，在體外能使宿主細(xì)胞產(chǎn)生空泡變性，VacA還可引起線粒體膜通透性改變，抑制細(xì)胞凋亡[2]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[3]、促進(jìn)HCO3-釋放并降低胃酸分泌[4]等。針對特異性識別VacA的研究主要體現(xiàn)在肽[5]、單鏈抗體（scFv）[6]、卵黃抗體[7]和單克隆抗體[8]，然而具有親和力高、穩(wěn)定性好、免疫原性低、分子量小、易于基因工程改造的納米抗體[9-10]卻未見報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)聚焦抗Hp細(xì)胞空泡毒素納米抗體的研究，構(gòu)建了納米抗體噬菌體免疫文庫，采用固相親和淘選技術(shù)，從該文庫中獲得了抗幽門螺桿菌VacA納米抗體，通過基因工程技術(shù)獲得了原核表達(dá)的納米抗體，并進(jìn)行了初步功能鑒定，為抗幽門螺桿菌VacA納米抗體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

幽門螺桿菌J99菌株質(zhì)粒由南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉瓊講師提供；大腸桿菌TG1、噬菌粒載體pComb3XSS、輔助噬菌體M13KO7、原核表達(dá)載體（pET25b）為實(shí)驗(yàn)室保存；卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白（BSA），購自上海生工生物工程有限公司；TA克隆試劑盒購自Takara；EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 獲取幽門螺桿菌VacA基因及原核表達(dá)

據(jù)NCBI上AF049653.1的VacA基因設(shè)計(jì)引物，VacA-F1為 5'-GGAATTCCGAAATACAACAA ACACACCGC-3'（EcoRI），VacA-R1 為 5'-CCG CTCGAGCGGATTGGTACCTGTAGAAACATTAC-3'（xhoI）。以Hp菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增VacA基因。根據(jù)Mighty TA-cloning Kit進(jìn)行TA克隆以減小序列突變的概率，電轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)中，菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆并測序。EcoRI和HindⅢ雙酶切pMD20-T-VacA質(zhì)粒和pET25b質(zhì)粒，酶連電轉(zhuǎn)至E.coliRosetta感受態(tài)中，1 mmol/L IPTG 25 ℃誘導(dǎo)4 h，超聲破碎SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 重組蛋白的變性、純化及復(fù)性

目的蛋白用包涵體洗滌液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton-100）洗滌，加入包涵體變性液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT，8 mol/L尿素），于4 ℃下變性1 h，離心取上清過Ni柱純化，在含高純度目的蛋白的洗脫液中加入等體積的復(fù)性液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L GSH，0.3 mmol/L GSSG，0.5 mol/L L-精氨酸）3次以逐步稀釋尿素濃度，用10 kDa透析管透析后備用。

1.2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建

用滅活的HpJ99菌株四次免疫羊駝后取血提總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過巢式PCR方法獲得VHH基因，第一步以AlpVh-LD（5'-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3'） 和 CH2-R（5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'） 為 引物，擴(kuò)增出約700 bp的VH域；第二步以VHH-1（5'-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3'） 和 VHH-2（5'-CATGCC ATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCG CTGTGGTGCG-3'）或 VHH-3（5'-CATGCCATGACT CGCGGCCGGCCTGGCCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCT TGGG-3'）為引物，擴(kuò)增出約500 bp的VHH基因。VHH基因和噬菌粒載體pComb3XSS用S fiⅠ單酶切，T4DNA連接酶連接后電轉(zhuǎn)至E.coliTGI感受態(tài)細(xì)胞中，固態(tài)培養(yǎng)12 h，M13KO7輔助噬菌體感染，構(gòu)建抗Hp納米抗體的噬菌體展示文庫，并通過插入率、庫容及多樣性評估文庫質(zhì)量。

1.2.4 抗Hp納米抗體噬菌體展示文庫的淘選及陽性噬菌體鑒定

以重組蛋白VacA為靶點(diǎn)，從納米抗體噬菌體展示免疫庫中篩選出能特異性結(jié)合VacA的納米抗體。按表1條件進(jìn)行三輪篩選，每一輪篩選后，取10 μL洗脫物測滴度，剩余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪的篩選。間接phage-ELISA鑒定陽性菌，具體操作方法參照文獻(xiàn)[11]。OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2視為陽性菌，將陽性菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證并測序。

表1 固相淘選條件

1.2.5 抗重組幽門螺桿菌VacA納米抗體的原核表達(dá)

根據(jù)EasyGeno快速重組克隆試劑盒設(shè)計(jì)能特異性擴(kuò)增VHH基因的引物F'（5'-AGCCGGCGATGGCCATGCAGTTGCAGCTCGTGGATGC-3'） 和R'（5'-ATCTCGAGTGCGGCCGCCTGGCCGGCCTGGCC GTCTTG-3'），pET25b（+）用 Nco Ⅰ和 Not Ⅰ雙酶切后，按EasyGeno快速重組克隆試劑盒配制10 μL的連接體系，于50 ℃反應(yīng)15 min立即冷卻鈣轉(zhuǎn)至Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中固態(tài)過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并測序。用0.1 mmol/L IPTG振蕩培養(yǎng)6 h超聲破碎，將含有目的蛋白的上清進(jìn)行Ni柱純化，SDS-PAGE鑒定純化結(jié)果。

1.2.6 鑒定抗重組幽門螺桿菌VacA納米抗體結(jié)合Hp的活性

通過間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA），鑒定原核表達(dá)的抗VacA納米抗體結(jié)合Hp的活性[11]，包被3 μg/mL的幽門螺桿菌全菌蛋白，結(jié)合時(shí)，加入不同濃度的納米抗體，測OD450，根據(jù)OD450樣本值/OD450空白對照值≥2時(shí)，即認(rèn)為納米抗體在該濃度下具有結(jié)合幽門螺桿菌的能力。

1.2.7 抗重組幽門螺桿菌VacA納米抗體抑制Hp鑒定

通過在一定時(shí)間內(nèi)測定CO2濃度的變化，評估納米抗體抑制幽門螺桿菌活性的能力，即體外培養(yǎng)幽門螺桿菌至1×109CFU與不同濃度的納米抗體于4 ℃下孵育16 h，加入100 μL 500 mmol/L尿素和0.2 g/L的酚紅混合液于37 ℃下孵育3 h，每30 min測定OD550，根據(jù)公式（1）計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 幽門螺桿菌VacA基因的擴(kuò)增、蛋白表達(dá)及純化

瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1A所示，大約2 200 bp左右有一條與幽門螺桿菌VacA基因理論分子量大?。? 248 bp）相近的條帶，故成功擴(kuò)增到幽門螺桿菌VacA基因片段。陽性克隆子原核表達(dá)后SDS-PAGE電泳如圖1B所示，VacA重組蛋白分子量大小約85 kDa，與理論值相符，復(fù)性后獲得高純度的目的蛋白。

圖1 幽門螺桿菌VacA PCR產(chǎn)物及蛋白鑒定圖

2.2 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建

如圖2A所示，在泳道1中可見18S和28S兩條帶，表明RNA沒有降解。兩步巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增VHH基因片段，第一步巢式PCR產(chǎn)物鑒定如圖2B所示，750 bp左右出現(xiàn)長鉸鏈重鏈抗體編碼的可變區(qū)基因目的條帶；第二步反應(yīng)以第一步回收純化后的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，如圖2C所示，在450 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期擴(kuò)增的VHH片段大小相符的條帶，純化PCR產(chǎn)物將其與噬菌粒載體pComb3XSS分別進(jìn)行S fiⅠ酶切，酶連后電轉(zhuǎn)至E.coliTGI感受態(tài)中，37 ℃固態(tài)培養(yǎng)12 h，隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。如圖3A所示，在650 bp左右有條帶，計(jì)算出VHH基因插入率為87.5%，測序后進(jìn)行多序列比對結(jié)果如圖3B所示，21個(gè)陽性克隆的基因均為編碼VHH的基因序列，抗體庫的有效庫容達(dá)到4.68×107CFU。

圖3 噬菌體展示文庫菌落PCR鑒定及序列比對圖

圖2 VHH總RNA及巢式PCR產(chǎn)物鑒定圖

2.3 抗幽門螺桿菌納米抗體噬菌體展示文庫的淘選

以重組蛋白VacA為靶分子，經(jīng)過3輪固相淘選，每輪以“吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增”為主要步驟，逐輪降低靶分子包被濃度、文庫投入量，通過增加洗滌次數(shù)來富集特異性結(jié)合VacA的納米抗體，結(jié)果如表2所示，噬菌體克隆得到有效富集。

表2 各輪淘選中結(jié)合VacA的噬菌體克隆的滴度和富集度

2.4 間接phage-ELISA鑒定陽性克隆

包被重組蛋白VacA，間接phage-ELISA鑒定陽性菌，將OD450樣本值/OD450陰性對照值≥2的噬菌體送測序，采用Alignment進(jìn)行多序列對比分析，得到6種抗體序列，選取吸光度值較高的陽性噬菌體進(jìn)行交叉驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示?？寺V2-36 OD450值較高且與BSA和OVA無交叉反應(yīng)，因此，采用HV2-36進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 間接phage-ELISA鑒定陽性菌

2.5 表達(dá)載體pET25b（+）-HV2-36的構(gòu)建及納米抗體的表達(dá)與純化

陽性克隆的菌落PCR鑒定結(jié)果如圖5A所示，在750 bp處擴(kuò)增到目的條帶及測序結(jié)果表明，表達(dá)載體pET25b（+）-HV2-36構(gòu)建成功。將重組表達(dá)載體鈣轉(zhuǎn)至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h，SDS-PAGE鑒定純化效果，結(jié)果如圖5B所示，在20 kDa處有符合目的蛋白分子量大小的條帶。

圖5 納米抗體重組載體克隆子的菌落PCR鑒定及原核表達(dá)圖

2.6 HV2-36結(jié)合幽門螺桿菌的活性分析

以破碎的幽門螺桿菌全菌蛋白為檢測抗原，分別測定不同濃度的納米抗體HV2-36結(jié)合幽門螺桿菌的活性。如圖6所示，納米抗體濃度為112.4 μg/mL時(shí)對Hp幾乎無結(jié)合力。

圖6 間接ELISA鑒定納米抗體結(jié)合幽門螺桿菌活性圖

2.7 納米抗體HV2-36抑制幽門螺桿菌活性分析

不同濃度的納米抗體與109CFU幽門螺桿菌J99菌株孵育，通過檢測一定時(shí)間內(nèi)CO2濃度的變化，分析納米抗體抑制Hp活性的能力。如圖7所示，當(dāng)納米抗體濃度在30 μg/mL時(shí)，HV2-36抑制率為31.13%。

幽門螺桿菌是一種引起多種疾病的革蘭氏陰性微需氧菌，其致病性主要與尿素酶B[12]、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A、細(xì)胞空泡毒素[13]、黏附素[14]等致病因子有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以重組蛋白VacA為靶標(biāo)，從Hp滅活菌免疫后構(gòu)建的噬菌體展示文庫中篩選出與重組蛋白VacA特異性結(jié)合的陽性噬菌體，測序發(fā)現(xiàn)，從多樣性較好的文庫中，淘選獲得了6種不同序列的陽性噬菌體。具有獨(dú)特性質(zhì)的納米抗體，不僅能夠結(jié)合細(xì)菌表面抗原，拮抗細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附[15]，還可通過拮抗細(xì)菌侵襲有關(guān)的毒力因子產(chǎn)生抗菌作用[16]?？鼓蛩孛窧納米抗體能有效抑制尿素酶的活性，從而減少Hp在胃黏膜上皮細(xì)胞的定植，所以納米抗體被認(rèn)為是一種頗具前景的Hp感染的治療方法[17-18]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)挑選出與重組蛋白VacA結(jié)合力較高的HV2-36進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建，獲得了可溶性好且表達(dá)量高的HV2-36納米抗體，采用間接ELISA鑒定其能特異性結(jié)合Hp。HV2-36納米抗體濃度為30 μg/mL時(shí)，對Hp抑制率達(dá)到了31.13%，該研究結(jié)果為使用納米抗體檢測和治療幽門螺桿菌感染奠定了基礎(chǔ)。