鄭剛，王奇，肖金星，楊志堅(jiān)，陳沖，趙小立*

（1.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江舟山 316100；2.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類[1]；膠原蛋白降解酶指的是一類能降解天然非變性膠原蛋白的酶[2]。膠原蛋白酶是重要的商業(yè)化酶，許多細(xì)菌來(lái)源的膠原蛋白酶已被成功鑒定和表征。盡管海洋中的生物資源豐富，但是這些商業(yè)化酶中很少有海洋來(lái)源，特別是海洋細(xì)菌。本研究旨在篩選出一株產(chǎn)膠原蛋白酶的海洋細(xì)菌，提高水產(chǎn)品加工廠中廢棄物的利用率。通過(guò)透明圈法篩出一株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株，通過(guò)肉眼初步觀察其形態(tài)學(xué)特征，隨后提取其16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，以確定其種屬來(lái)源；同時(shí)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，確定其親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

UNIVERSAL HOOD凝膠成像儀，BIO-RAD；eStain L1蛋白染色儀，金斯瑞；R 134 a冷凍離心機(jī)，Eppendorf；H1850R醫(yī)用離心機(jī)、TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀；DW-86L386超低溫冰箱，青島海爾；YXQ-LS-50 S Ⅱ高壓蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊；eclipse E200光學(xué)顯微鏡，Nikon；HS-840超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰；UV-1800分光光度計(jì)，Shimadzu；ZQZY-88CN搖床，上海知楚；AL204電子天平、FiveEasy pH計(jì)，METTLER TOLEDO。

1.2 材料與試劑

葡萄糖（99%），瓊脂粉、蛋白胨、酵母粉、Triton X-100為分析純，購(gòu)自上海生工；明膠，三氯乙酸、乙二醇甲醚為分析純，購(gòu)自阿拉??；二水還原茚三酮，分析純，購(gòu)自源葉生物；水合茚三酮，分析純，購(gòu)自阿法埃莎公司；乙酸、乙酸鈉、氯化鈣等為分析純，購(gòu)自國(guó)藥公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×非變性蛋白上樣緩沖液，購(gòu)自上海碧云天。

1.3 溶液制備

劃線培養(yǎng)基：1.0%明膠、1.0%酵母粉、1.0%葡萄糖，加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min；固體培養(yǎng)基還需加入1.5%的瓊脂。

種子發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5%蛋白胨、1.5%的葡萄糖、1.0%的酵母粉，再加上七水硫酸鎂0.2 g、磷酸氫二鉀0.1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、氯化鈣0.2 g，加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%明膠、1.0%蛋白胨、1.0%氯化鈉、1.5%的葡萄糖，加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min。

2 mol/L pH 5.4的乙酸緩沖液：86 mL 2 mol/L的乙酸鈉與14 mL 2 mol/L乙酸混勻，調(diào)節(jié)pH至5.4。

茚三酮顯色液：稱取0.85 g水合茚三酮和0.166 8 g二水還原茚三酮，溶于100 mL乙二醇甲醚中，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。

0.1 mol/L pH 7.5的Tris-HC1（50 mmol/L氯化鈣）緩沖液：稱取1.21 g Tirs用少量去離子水溶解，并加入0.555 g氯化鈣，調(diào)節(jié)pH為7.5，定容至100 mL。

底物溶液：2 g/L的明膠溶液。

洗脫液：稱取0.605 g Tris、0.555 g氯化鈣，吸取2.5 mL Triton X-100溶液，加水混勻定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH為7.5。

孵育液：稱取1.0%明膠、0.5%氯化鈉，加去離子水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.5，115 ℃下高溫滅菌20 min。固體培養(yǎng)基還需加入1.5%的瓊脂。

1.4 產(chǎn)膠原蛋白酶菌株的篩選

1.4.1 初篩

在浙江舟山水產(chǎn)品加工廠污水處理廠中，采集不同處理池的污水和污泥以及近海域的海水。在無(wú)菌環(huán)境中，分別取1 mL污水、海水和1 g污泥樣品，使用0.9%的生理鹽水溶液對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)10倍的梯度稀釋。取0.2 mL不同稀釋倍數(shù)的樣品均勻涂布在明膠初篩選培養(yǎng)基平板上，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)。由于膠原蛋白酶可以降解明膠，而35%的三氯乙酸溶液會(huì)使蛋白質(zhì)變性。因此，當(dāng)明膠被水解后，菌落周圍的培養(yǎng)基在三氯乙酸作用下會(huì)形成肉眼可見(jiàn)的透明圈，以透明圈的大小作為篩選產(chǎn)膠原蛋白酶菌產(chǎn)酶能力的標(biāo)準(zhǔn)。通常情況下，透明圈直徑的大小與菌株產(chǎn)酶能力成正比。因此，挑取透明圈較大、長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落再培養(yǎng)，作為進(jìn)一步篩選工作的出發(fā)菌株。

1.4.2 復(fù)篩

經(jīng)過(guò)菌株初篩后，分離得到一定數(shù)目的菌株。分別取少量菌液點(diǎn)在明膠初篩培養(yǎng)基平板中央，并將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，取出平板，均勻涂布35%的三氯乙酸溶液，觀察并記錄平板上形成透明圈的情況。選取透明圈直徑與菌落比值（HC值）較大的初篩菌株進(jìn)行后續(xù)研究。進(jìn)一步將所選菌株接入種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下在氣浴搖瓶中培養(yǎng)至OD值達(dá)到1.0后得到種子培養(yǎng)液。隨后，取2.5 mL不同樣品的種子培養(yǎng)液分別接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量為50 mL發(fā)酵液的250 mL錐形瓶）繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后收集得到的發(fā)酵液（取2 mL樣品，于12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液）。由于茚三酮顯色液檢測(cè)甘氨酸濃度時(shí)，會(huì)受到發(fā)酵液中存在的其他氨基酸分子的干擾，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。因此，收集得到的上清液還需進(jìn)行進(jìn)一步的處理：經(jīng)過(guò)10 kD、0.5 mL的超濾管超濾，用無(wú)菌水沖洗3次，12 000 r/min、4 ℃下離心10 min，再將酶液定容至原體積，即為最終需要檢測(cè)的樣品。由于此過(guò)程會(huì)有酶損耗，實(shí)際酶活會(huì)比測(cè)量值大。每組樣品重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 酶活測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6只相同規(guī)格的試管，依次加入濃度為0 mmol/L、0.06 mmol/L、0.12 mmol/L、0.18 mmol/L、0.24 mmol/L、0.30 mmol/L的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL。然后加入1 mL乙酸緩沖液并混勻，加入1 mL茚三酮顯色液，混合后沸水浴15 min，隨后放在自來(lái)水中冷卻5 min，加入3 mL 60%乙醇，充分混合后，使用分光光度計(jì)在570 nm下測(cè)量吸光值。以甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 樣品測(cè)定

以0.2%的明膠溶液為底物，反應(yīng)體系為：0.2%的明膠溶液50 μL和0.1 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl（含50 mmol/L CaCl2）溶液50 μL混合，粗酶液25 μL，在37 ℃反應(yīng)0.5 h，加入10%三氯乙酸溶液125 μL終止反應(yīng)。隨后，加入乙酸緩沖液250 μL，混勻，再加入茚三酮顯色液250 μL，混勻。再將混合溶液置入沸水浴中15 min，后于冷水中冷卻5 min，再加入60%乙醇750 μL。充分混合后，使用分光光度計(jì)測(cè)量溶液在570 nm下的吸光值。由于茚三酮顯色液不是很穩(wěn)定，在顯色1 h內(nèi)需測(cè)完OD值，否則結(jié)果不準(zhǔn)確。茚三酮顯色法可以測(cè)定體系中的水溶性氨基酸和短肽。通常在采用該方法時(shí)會(huì)以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行檢測(cè)。酶活力單位定義為：在37 ℃、pH 7.5條件下，每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol甘氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位U。為了盡量減小誤差，要求發(fā)酵液現(xiàn)取現(xiàn)測(cè)[3]。

1.6 菌種分離純化

經(jīng)過(guò)菌株的復(fù)篩后，將得到的菌液通過(guò)劃線法在明膠劃線培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，得到單菌落。

1.7 菌種的保存

將劃線得到的單菌落接種入種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、180 r/min。菌液OD值達(dá)到1.0后，取1 mL的菌液與等體積的50%甘油混合，后將混合液移至凍存管，保藏于-80 ℃冰箱中備用。

1.8 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的繪制

取凍存管中的菌液，在平板上劃線活化菌株。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下的氣浴搖瓶中培養(yǎng)至OD值達(dá)到1.0后得到種子培養(yǎng)液。再取種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。從接種時(shí)起第一次取樣，然后每隔2 h取樣一次。每次取樣4 mL發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)：2 mL樣品用于檢測(cè)菌株生長(zhǎng)情況，以新鮮培養(yǎng)基作為參照測(cè)定菌液在OD600下的吸光值；2 mL樣品用于檢測(cè)發(fā)酵液中的產(chǎn)酶情況，即采用茚三酮法檢測(cè)發(fā)酵液中的酶活。每組樣品重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.9 菌落和細(xì)胞的形態(tài)觀察

取凍存管中的菌液，在平板上劃線活化菌株。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下的氣浴搖瓶中培養(yǎng)至OD值達(dá)到1.0后得到種子培養(yǎng)液。取菌液制片后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、繁殖方式和運(yùn)動(dòng)能力等特征情況。同時(shí)，將菌液稀釋后再次劃線，以期得到生長(zhǎng)良好、便于觀察的單菌落。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出生長(zhǎng)良好的單菌落后，對(duì)菌落的形貌特征進(jìn)行觀測(cè)記錄。

1.10 生理生化試驗(yàn)分析

以《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中所介紹的菌種分類鑒定方法，對(duì)篩選得到菌株進(jìn)行生理生化特征分析。

1.11 分子生物學(xué)鑒定

取2 mL篩選得到的菌株種子液，送至杭州擎科生物公司進(jìn)行菌屬鑒定，并對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

1.12 明膠酶譜鑒定

在常規(guī)的SDS-PAGE分離膠中加入溶度為1%的明膠，使明膠在分離膠中的終濃度達(dá)到0.1%，明膠SDS-PAGE體系如表1所示。上樣緩沖液為非變性還原條件，將發(fā)酵上清液離心后超濾，和上樣緩沖液混勻后靜置10 min，在冰浴的條件下電泳。電泳結(jié)束后，搖晃條件下將凝膠在洗脫液中浸泡復(fù)性45 min，2次；再在孵育液中搖晃溫浴30 min，2次。之后將凝膠取下來(lái)，在蛋白染色儀中染色、脫色，觀察水解帶的出現(xiàn)[4]。

表1 明膠SDS-PAGE體系

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

本實(shí)驗(yàn)主要以是否能水解明膠作為初步篩選產(chǎn)膠原蛋白酶菌株的依據(jù)。試驗(yàn)從海水樣中經(jīng)過(guò)菌液富集、平板涂布以及菌株挑選等常規(guī)步驟入手，根據(jù)初篩培養(yǎng)基平板上菌株形成透明圈的大小，最終成功分離到了10株具有明顯水解明膠能力的菌株。將這些菌依次命名為YQ-1至YQ-10菌，并利用復(fù)篩方法進(jìn)一步測(cè)定每種菌株發(fā)酵液中的產(chǎn)酶活力大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 各菌種酶活和對(duì)應(yīng)HC值的大小

根據(jù)所測(cè)得各菌種所產(chǎn)膠原蛋白酶酶活的高低，結(jié)合相對(duì)應(yīng)的菌落水解圈大小，最終確定以菌株YQ-1作為出發(fā)菌種進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究，此時(shí)該菌的酶活為（12.4±0.4）U/mL，其形成的水解圈如圖2所示。

圖2 菌株YQ-1水解圈

2.2 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)定不同濃度甘氨酸的OD570值，制成由圖3所示的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以標(biāo)定膠原蛋白酶活力，通過(guò)曲線擬合得到線性標(biāo)準(zhǔn)方程為y=5.152x，R2=0.995 9＞0.99，數(shù)值可用。

圖3 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由此可得酶活（U/mL）計(jì)算公式如公式（1）所示。

式（1）中，75為甘氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量；N為稀釋倍數(shù)；30為反應(yīng)時(shí)間。

2.3 菌株YQ-1生長(zhǎng)曲線和酶活力曲線

圖4為菌株YQ-1的生長(zhǎng)曲線，可以看出其依次經(jīng)歷了遲滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期4個(gè)不同的生長(zhǎng)時(shí)期。從菌株的生長(zhǎng)曲線不難發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)菌在培養(yǎng)4 h后，呈現(xiàn)出明顯的指數(shù)式增長(zhǎng)趨勢(shì)；接近14 h時(shí)，生長(zhǎng)速度則逐漸放緩，隨即達(dá)到穩(wěn)定期；穩(wěn)定期持續(xù)10 h后進(jìn)入衰亡期。而菌株在8 h左右才開(kāi)始產(chǎn)酶，是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中含有明膠，在前幾個(gè)小時(shí)，菌株產(chǎn)酶量較低，明膠還沒(méi)有被降解，培養(yǎng)基中明膠含量高導(dǎo)致溶液呈膠狀，無(wú)法測(cè)出酶活，在發(fā)酵8 h后，溶液的明膠含量降低，才能檢測(cè)出酶活，在40 h左右酶活達(dá)到最大，此時(shí)菌體濃度開(kāi)始顯著下降，說(shuō)明菌體濃度顯著影響菌株產(chǎn)酶。

圖4 YQ-1菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

2.4 菌落和細(xì)胞的形態(tài)特征

菌株YQ-1在明膠培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d后，出現(xiàn)質(zhì)地均一的菌落。同時(shí)可以觀察到：菌落呈淡黃色，外輪廓規(guī)整且不黏稠，中間凸起，似水滴狀。鏡檢發(fā)現(xiàn)為短桿狀、有鞭毛，革蘭氏陰性。菌落形態(tài)效果如圖5及6所示。

圖5 YQ-1涂布平板形成的菌落形態(tài)

圖6 YQ-1顯微鏡形態(tài)圖

2.5 生理生化試驗(yàn)結(jié)果及分析

以《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中所介紹的菌種分類鑒定方法，對(duì)菌株YQ-1進(jìn)行生理生化特征分析。結(jié)果顯示此菌為好氧菌，能對(duì)大部分的糖類和少數(shù)的醇類合理利用，具有水解酪素、明膠的能力，繁殖速度快，無(wú)淀粉酶活力，對(duì)生存環(huán)境的溫度要求不高，具體結(jié)果如表3所示。

表3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.6 分子生物學(xué)鑒定

培養(yǎng)并收集YQ-1菌菌液，采用CTAB/NaCl法提取基因組DNA，采用通用引物以基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到基因序列的長(zhǎng)度為1 396 bp，利用Genbank中的BLAST程序檢索結(jié)果表明該菌與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的相似度極高，幾乎接近100%，因此將其確定為Stenotrophomonas maltophilia YQ-1。同時(shí)選擇合適的模式菌株16S rRNA基因序列應(yīng)用Clustal W (Version 2.0)進(jìn)行多序列比對(duì)，再用Mega 7.0軟件構(gòu)建出YQ-1菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖7所示。

圖7 基于16S rRNA序列構(gòu)建嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YQ-1與近源菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.7 明膠酶譜鑒定結(jié)果

活性膠原蛋白變性后以明膠的方式存在，明膠酶和膠原蛋白酶有一定的相似性，活性膠原蛋白容易變性，不易溶解。因此，以明膠為活性底物，制備明膠SDSPAGE，對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YQ-1發(fā)酵液進(jìn)行明膠酶活性分析，產(chǎn)生的胞外明膠酶結(jié)果如圖8所示。可以看出，該菌株胞外至少產(chǎn)生2種不同的明膠活性的酶。

圖8 明膠酶活性電泳分析

3 結(jié)論

本文從海水樣中篩選出一株能在明膠平板上產(chǎn)生透明圈的菌株，綜合菌株的形態(tài)、生理生化以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析等方面的試驗(yàn)結(jié)果，菌株YQ-1被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬；形態(tài)為圓形、淡黃色。對(duì)該菌進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其能夠產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶、能分解酪素、無(wú)淀粉酶活性，能對(duì)大部分的糖類和少數(shù)的醇類合理利用；此菌為好氧菌，繁殖速度快，生長(zhǎng)周期短，對(duì)生存環(huán)境的溫度要求不高；該菌還能產(chǎn)生至少2種具有明膠活性的酶。目前，有關(guān)膠原蛋白酶活力體系比較成熟的是來(lái)源于溶組織梭菌，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的研究報(bào)道很少，沒(méi)有相關(guān)的膠原蛋白酶活力的系統(tǒng)，具備深入優(yōu)化研究的價(jià)值。