胡慧慧，紀(jì)昂，張明慧，馮亞莉

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南新鄭 451100）

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicas Houtt.的新鮮或干燥地上部分[1]，又稱茺蔚、坤草、月母草、旋風(fēng)草、益母蒿等，歸心、肝、膀胱經(jīng)，其味苦、辛，性微寒?！侗静菥V目》記載：“此草及子皆茺盛密蔚，故名茺蔚，其功宜于婦人及明目之精，故有益母之稱”。益母草有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒之功能，素有“血家圣藥”“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，益母草對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟等有保護(hù)作用，還具有抗癌、抗炎、抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、抑制胰脂肪酶活性等藥理作用[3-5]。益母草的化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要有生物堿類、黃酮類、二萜類、揮發(fā)油類、多肽類等[6]，其中生物堿類成分是益母草的主要藥效物質(zhì)，包括鹽酸益母草堿和水蘇堿等[7]。本文采用水提、回流、超聲等不同提取方法對(duì)益母草中總生物堿和鹽酸益母草堿的提取率進(jìn)行了研究，采用雷氏鹽剩余比色法測(cè)定總生物堿的含量，采用HPLC法測(cè)定鹽酸益母草堿的含量，以確定益母草的最佳提取工藝，從而為益母草藥品的炮制、制劑開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

干燥益母草購(gòu)于亳州市張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院謝新年教授鑒定為唇形科植物益母草的干燥地上部分，粉碎后備用。

1.2 儀器與試劑

UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；HPLC-1260高效液相色譜儀，中國(guó)安捷倫科技有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器公司；超聲波清洗機(jī)，濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LG10-2.4A離心機(jī)，深圳永業(yè)昌機(jī)電有限公司；FW177中藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

對(duì)照品鹽酸水蘇堿，批號(hào)YS210722、鹽酸益母草堿，批號(hào)YS181221，純度≥98%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雷氏鹽，批號(hào)180901，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙腈，批號(hào)180324，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇，批號(hào)180409，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他所用試劑和溶劑均為分析純。

1.3 提取方法

1.3.1 水提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，適量蒸餾水浸泡過(guò)夜，水煎煮3次，溶劑用量分別為10倍、6倍、5倍，提取時(shí)間分別為2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁熱抽濾，合并濾液，冷卻，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.3.2 酸水提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以1%鹽酸水溶液浸泡過(guò)夜，煎煮提取3次，溶劑用量分別為10倍、6倍、5倍，提取時(shí)間分別為2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁熱抽濾，合并濾液，冷卻，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.3.3 乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以95%乙醇浸泡過(guò)夜，加熱回流提取3次，溶劑用量分別為10倍、6倍、5倍，提取時(shí)間分別為2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁熱抽濾，合并濾液，冷卻，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.3.4 酸性乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以0.1%鹽酸的95%乙醇溶液浸泡過(guò)夜，加熱回流提取3次，溶劑用量分別為10倍、6倍、5倍，提取時(shí)間分別為2.0 h、1.5 h、1.0 h，趁熱抽濾，合并濾液，冷卻，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.3.5 乙醇超聲提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，以10倍量的95%乙醇浸泡過(guò)夜，置超聲清洗機(jī)中處理40 min，抽濾，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.3.6 索氏乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，在索氏提取器中，以10倍量的95%乙醇溶液提取至虹吸管無(wú)色為止，抽濾，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.3.7 索氏酸性乙醇提取法

取干燥益母草粗粉10.00 g，在索氏提取器中，以10倍量的0.1%鹽酸的95%乙醇溶液提取至虹吸管無(wú)色為止，抽濾，濃縮至10.00 mL，自然揮發(fā)成浸膏或干浸膏，備用。

1.4 含量測(cè)定方法

1.4.1 總生物堿含量測(cè)定

采用雷氏鹽剩余比色法測(cè)定樣品中總生物堿的含量。生物堿的硫氰酸鉻銨鹽沉淀溶于丙酮中，溶解成的紫紅色液體在510 nm波長(zhǎng)下有最大吸收。

樣品溶液的制備：取適量不同提取方法得到的益母草提取物，以0.1 mol/L的鹽酸超聲溶解，過(guò)濾，所得濾液用相同鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶中。

分別取上述樣品溶液5.00 mL于小燒杯中，緩慢滴加新鮮配制的2%雷氏鹽溶液5.00 mL，置冰箱中過(guò)夜，過(guò)濾后得紫紅色沉淀，用冷水洗滌沉淀至無(wú)色，抽濾。沉淀用丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。以丙酮為空白，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度（A），代入式（1）可計(jì)算總生物堿量，根據(jù)式（2）求出總生物堿的得率。

式（1）中，M為鹽酸水蘇堿的相對(duì)分子質(zhì)量，值為179.63；ε是硫氰酸鉻銨在丙酮中的分子吸收系數(shù)，值為106.5；V為待檢測(cè)的溶液體積，100 mL。

1.4.2 鹽酸益母草堿含量測(cè)定

（1）色譜條件：采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中鹽酸益母草堿的含量。參照《中國(guó)藥典》[1]中鹽酸益母草堿高效液相色譜法含量測(cè)定條件，選用以下色譜條件對(duì)7種提取方法得到的鹽酸益母草堿進(jìn)行定量分析。色譜柱：SBC-18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（24∶76）；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；流速：1.00 mL/min；柱溫：30 ℃。

（2）對(duì)照品溶液的制備[1]：精密稱定鹽酸益母草堿對(duì)照品0.2000 mg，用70%乙醇定容在1 mL容量瓶中，即得濃度為0.2000 mg/mL的對(duì)照品溶液。

（3）樣品溶液的制備[8]：取7種不同提取方法得到的浸膏，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次20.00 mL，收集正丁醇后段液層，蒸干，再用70%乙醇定容到10 mL容量瓶，離心，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待進(jìn)樣。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取適量鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液，加70%乙醇配制成含鹽酸益母草堿濃度分別為0.006 mg/mL、0.015 mg/mL、0.030 mg/mL、0.060 mg/mL、0.120 mg/mL等標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。上述色譜條件下將10 μL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液精密吸取注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定。以鹽酸益母草堿峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，稀釋后溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（5）樣品測(cè)定：分別精密量取10 μL樣品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液中鹽酸益母草堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總生物堿含量測(cè)定結(jié)果

不同提取方法所得提取物中總生物堿含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可得，采用不同提取方法得到的益母草總生物堿的得率不同，提取得到的益母草總生物堿量與提取方法和溶劑都有一定的相關(guān)性。采用回流提取法，用0.1%鹽酸的95%乙醇溶液進(jìn)行提取時(shí)，益母草總生物堿的提取率最高，同時(shí)該方法得到的浸膏量少，即雜質(zhì)量較少。因此，可以采用0.1%鹽酸的95%乙醇溶液回流提取法對(duì)益母草藥材進(jìn)行提取。

表1 不同提取方法所得益母草提取物的浸膏得率和總生物堿量比較

2.2 鹽酸益母草堿的含量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=17 741X-7.395，r=0.999 4。結(jié)果表明鹽酸益母草堿在0.06～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 樣品中鹽酸益母草堿的含量測(cè)定

由表2可以看出，7種不同的提取方法中，酸性乙醇回流提取法提取得到的鹽酸益母草堿的含量最多，含量為0.282 mg/g，得率為0.028 2%。

表2 不同提取方法的樣品中鹽酸益母草堿含量分析

3 結(jié)論

以0.1%鹽酸的95%乙醇溶液為溶劑，采用回流提取法得到的益母草總生物堿和鹽酸益母草堿含量均為最高，分別為2.14 mg/g和0.282 mg/g，且樣品中雜質(zhì)少，利于富集。這可能是由于益母草生物堿結(jié)構(gòu)上胍基基團(tuán)的存在，使之易于與酸成鹽，因此在酸性乙醇溶液中溶解性較大，提取率也高。本文的工作為益母草中藥制劑的開(kāi)發(fā)以及其藥理作用的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。