李華健，陳 韜，楊波若，李 霞，李燕清，王博文，卞健科，舒國濤

（云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

持水性會影響豬肉的加工特性、感官品質和盈利能力，是豬肉最重要的品質之一[1-3]。肉畜屠宰后，由于汁液流失造成的質量損失一般在1%～10%之間[4]，過高的汁液流失易導致PSE（pale, soft, exudative）肉或RSE（reddish-pink,soft, exudative）肉，給肉類行業(yè)造成巨大的經濟損失[5]。因此，研究宰后豬肉持水性的影響因素具有直接的經濟價值和現實意義。

目前，國內外學者[6-7]主要應用相關性分析探討pH值、骨架蛋白變化與持水性的關系，其存在一定的局限性，因為相關性分析雖然能反映各變量與因變量的相關程度，但并不能完全反映出各變量對因變量的相對重要性，偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析則能對數據進行分解和篩選，克服變量多重相關性的影響，提取對因變量解釋性最強的變量，從而更好地反映出變量對因變量的相對重要性[8]，彌補相關性分析的不足。另外，研究者普遍認為：細胞膜骨架蛋白整聯蛋白（integrin）的降解有助于汁液流失通道的形成，增加汁液流失[9-10]。然而，肌細胞膜骨架蛋白不僅包含跨膜的整聯蛋白，還包含與膜相連的蛋白，如踝蛋白（talin）、黏著斑蛋白（vinculin）、抗肌營養(yǎng)不良蛋白（dystrophin）等，這些蛋白通過肋小節(jié)（costameres）將肌原纖維和細胞外基質間接地聯結起來[11]。整聯蛋白-踝蛋白、黏著斑蛋白復合物是肋小節(jié)中介導細胞-細胞和細胞-基質相互作用的主要受體復合物，其中整聯蛋白貫穿于肌細胞膜，外聯肌細胞外基質內接踝蛋白，黏著斑蛋白和踝蛋白相互作用調節(jié)整聯蛋白黏著斑的形成，對細胞彼此之間的附著十分重要[12-14]。由于踝蛋白、黏著斑蛋白與整聯蛋白在細胞中的位置和功能存在不同，可能會對持水性產生不同的影響[7]：Kristensen等[15]的研究表明豬肉宰后成熟過程中，黏著斑蛋白的緩慢降解和踝蛋白的快速降解與持水性的增加有關；Sch?fer等[16]研究認為黏著斑蛋白的降解與持水性無關；Bee等[6]的研究表明豬肉宰后48、72 h和120 h的踝蛋白表達水平與貯藏損失率呈顯著正相關（P＜0.05），宰后48 h的黏著斑蛋白表達水平與貯藏損失率呈顯著負相關（P＜0.05）；Di Luca等[17]通過蛋白組學研究發(fā)現汁液流失率低的肉樣黏著斑蛋白表達量更高。由此可見，踝蛋白和黏著斑蛋白與持水性的關系依然還存有爭議。近年，Puolanne等[18]提出肉的持水機理還不清楚，肌細胞膜骨架蛋白與持水性的關系應結合pH值、不同離子和蛋白質變性等進一步研究。因此，本研究主要運用相關性分析和PLSR分析探討pH值及整聯蛋白、踝蛋白、黏著斑蛋白變化與持水性之間的關系，以期為持水性的改善及預測宰后豬肉的汁液流失率提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在曲靖市某商業(yè)屠宰場，選擇6.5 月齡、飼養(yǎng)條件相同、體質量相近（（105±5）kg）的20 頭去勢三元雜交豬（大河烏豬×約克夏×長白豬），按照GB/T 17236—2019《畜禽屠宰操作規(guī)程 生豬》[19]進行屠宰，熱分割、胴體四分體后取13肋至最后腰椎處的背最長?。◣?、脂肪和骨），用塑料薄膜包裹，放在0～4 ℃冷庫中，在宰后不同時間點測定相關指標，并在各時間點取樣，用自封袋排氣封存于-80 ℃冰箱備用。根據宰后45 min的pH值經聚類分析，將樣品分為高pH組和低pH組。

β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、N,N’-雙-亞甲基丙烯酰胺、溴酚蘭、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）（分析純）、丙烯酰胺（超級純） 美國Amresco公司；過硫酸胺（ammonium persulfate，APS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 天津市風船化學試劑科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；預染Marker 美國Thermo公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、clone 8D4踝蛋白一抗 美國Sigma公司；MAB1900整聯蛋白一抗、MAB3574黏著斑蛋白一抗、AP181P二抗和0.45 μm的疏水性聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）轉印膜 美國Millipore公司；特超敏化學發(fā)光檢測試劑盒美國Everbright公司。

1.2 儀器與設備

HI9025C便攜式pH計 意大利哈納公司；全自動酶標儀 北京普朗新技術有限公司；通用電泳儀電源、小型垂直電泳系統(tǒng)、槽式轉印系統(tǒng)、ChemiDoc MP全能型成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值的測定

采用王娟等[20]的方法，用便攜式pH計測定宰后45 min和3、9、12、24 h豬背最長肌的pH值。每組樣品平行測量3 次取平均值。

1.3.2 汁液流失率的測定

參照Honikel[21]的方法測定汁液流失率，并稍作修改。于宰后24 h取2.5 cm厚背最長肌一片，用萬分之一天平稱質量（m1/g）。用鐵絲鉤住肉條的一端，使肌纖維垂直向下，懸掛于塑料袋中，充氣（肉樣不能和塑料袋接觸），扎緊袋口，在4 ℃條件下吊掛24 h，取出稱質量（m2/g）。汁液流失率按下式計算。

1.3.3 細胞骨架蛋白表達水平測定

采用Western blot技術測定踝蛋白（分子質量225 kDa）、整聯蛋白（分子質量116 kDa）和黏著斑蛋白（分子質量120 kDa）在不同時間點（宰后45 min和3、9、12、24 h）的降解情況。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）全肌肉蛋白樣品的制備參照Lonergan等[22]的方法并稍作修改。稱取0.8 g切碎的背最長肌肉樣，加入10 mL全肌肉蛋白提取液（10 mmol/L pH 7.0磷酸鈉、2 g/100 mL SDS），6 500 r/min勻漿30 s后在20 ℃、離心力1 500×g條件下離心20 min，取上清液，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質量濃度，用雙蒸水將質量濃度調至6.4 mg/mL。取1 mL 6.4 mg/mL蛋白質上清液與0.5 mL上樣緩沖液（30 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L EDTA、3 g/100 mL SDS、體積分數30%甘油、0.002 g/100 mL溴酚藍，pH 8.0）混合后加入0.1 mLβ-巰基乙醇（最終蛋白質濃度為4 mg/mL）。50 ℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫，存放于-80 ℃冰箱備用。

SDS-PAGE：踝蛋白、整聯蛋白和黏著斑蛋白分別使用質量分數8%、10%、10%的分離膠，濃縮膠都使用質量分數5%的凝膠。待膠凝聚后，向電泳槽中加入電泳緩沖液（25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L EDTA和0.1 g/100 mL SDS），對準膠孔注入蛋白質樣品。整聯蛋白、黏著斑蛋白和踝蛋白每個泳道上樣量分別為80、80、120 μg全肌肉蛋白樣液。按照Bee等[6]的方法從左至右依次加入5 μL預染Marker、參比蛋白樣品和宰后45 min～24 h的蛋白樣品（參比蛋白樣液由宰后45 min，高pH組中汁液流失率最小的樣品制備）。設定濃縮膠電壓80 V、30 min，分離膠電壓120 V、1 h，進行電泳。

轉膜：電泳結束后將凝膠轉移至PVDF膜。整聯蛋白和黏著斑蛋白在200 mA下轉印1.5 h，踝蛋白在220 mA下轉印2 h，整個過程在0 ℃下進行。轉印緩沖液由25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L EDTA和體積分數15%甲醇組成。

Western blotting：轉印后，將膜置于含有5 g/100 mL BSA的TBST緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、體積分數0.05% Tween 20，pH 7.5）中室溫封閉1 h，再置于一抗中4 ℃孵育過夜。一抗孵育完成后，在室溫下用TBST緩沖液洗膜3 次（10 min/次）。將洗過的膜置于二抗中室溫孵育1 h。二抗孵育完成后在室溫下用TBST緩沖液洗膜3 次（10 min/次）。將洗凈后的膜用化學發(fā)光試劑盒顯影，于暗室曝光。用ImageJ軟件分析完整的目標蛋白條帶灰度值，按照Bee等[6]的方法分別以蛋白條帶上5 個時間點所測的灰度值與每塊凝膠上加載的參比樣品灰度值之比（即相對灰度值），表示完整的目標蛋白表達水平。每張膜重復定量3 次求平均值。

一抗和二抗稀釋液都使用含3 g/100 mL BSA的TBST緩沖液。整聯蛋白和黏著斑蛋白的一抗稀釋比為1∶800（V/V，下同），踝蛋白一抗稀釋比為1∶500。整聯蛋白和黏著斑蛋白的二抗稀釋比為1∶8 000，踝蛋白的二抗稀釋比為1∶6 000。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0軟件計算數據的平均值和標準差，并進行Duncan’s多重比較、獨立性T檢驗和相關性分析（由于pH值數據不服從正態(tài)分布，因此pH值與骨架蛋白表達水平的相關性采用Spearman相關性分析）。鑒于PLSR法可以解決樣本量少、變量不服從正態(tài)分布等問題[23-24]，各變量與汁液流失率的關系采用Unscrambler 9.7軟件進行PLS1回歸分析。采用Origin 2018軟件進行繪圖。P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 聚類分析結果

圖1 宰后45 min樣品的pH值聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for pH of pork samples at 45 min postmortem

根據宰后45 min樣品pH值的大小進行聚類分析，結果如圖1所示。當歐氏距離增至9.5時，可將20 個樣品分成高pH組（pH45min≥6.00，n＝6）和低pH組（pH45min≤5.78，n＝14）。分組后，高pH組的汁液流失率極顯著低于低pH組（P＜0.01）（圖2）。此結果與Bee[6]、Zhang Muhan[25]等的研究結果一致。王娟等[20,26]的研究也表明，與雜交豬相比，具有較高持水性的梅山豬宰后45 min的pH值明顯更高（P＜0.05）。

圖2 不同pH值組肉樣的汁液流失率Fig.2 Drip loss of pork samples with different pH values

2.2 不同組別pH值和骨架蛋白的表達水平分析結果

圖3 宰后不同pH組樣品的pH值（A）和整聯蛋白（B）、黏著斑蛋白（C）、踝蛋白（D）表達水平的變化Fig.3 Changes in pH (A), and expression levels of integrin (B),vinculin (C), and talin (D) in pork samples with different pH values during postmortem aging

如圖3所示，高、低pH組之間的pH值和完整的骨架蛋白表達水平存在一定的差異。高pH組的pH值在宰后45 min和3、9、12 h都極顯著高于低pH組（P＜0.01），整聯蛋白表達水平在宰后9 h 極顯著高于低p H 組（P＜0.01），黏著斑蛋白表達水平在宰后3 h和9 h顯著高于低pH組（P＜0.05），踝蛋白表達水平在宰后3、9、12、24 h都顯著低于低pH組（P＜0.05）。

與宰后45 min相比，高pH組的pH值到宰后9 h顯著降低（P＜0.05），而低pH組到宰后3 h就顯著降低（P＜0.05），在宰后12～24 h兩組肉樣的pH值都有上升的趨勢，低pH組出現顯著上升（P＜0.05）。整聯蛋白在高pH組中未見顯著降解（P＞0.05），而低pH組在宰后3 h較宰后45 min出現顯著降解（P＜0.05）。高pH組宰后24 h的黏著斑蛋白較宰后3 h出現顯著降解（P＜0.05），低pH組宰后12 h的黏著斑蛋白較宰后45 min出現顯著降解（P＜0.05）。相對于宰后45 min，高pH組的踝蛋白在宰后9 h出現顯著降解（P＜0.05），低pH組在宰后12 h才出現顯著降解（P＜0.05）。說明pH值的降低可能會影響骨架蛋白的降解。何凡等[27]對宰后羊肉品質的研究也表明：在宰后45 min，低滴水損失組的pH值顯著高于高滴水損失組（P＜0.05），且pH值的下降會導致蛋白質降解，造成較高的汁液流失率。

2.3 pH值與骨架蛋白表達水平的相關性分析結果

表1 pH值與骨架蛋白表達水平的相關性分析結果Table 1 Correlation analysis between pH and expression levels of cytoskeletal proteins

如表1所示，在各時間點，整聯蛋白和黏著斑蛋白表達水平與pH值整體呈正相關性，踝蛋白與之相反。整聯蛋白表達水平在宰后3 h與宰后12 h的pH值呈顯著正相關（P＜0.05），在宰后9 h與宰后3、9、12 h的pH值呈極顯著正相關（P＜0.01），與宰后24 h的pH值呈顯著正相關（P＜0.05），在宰后12 h與宰后3 h的pH值呈顯著正相關（P＜0.05），在宰后24 h與宰后3 h和9 h的pH值分別呈顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）正相關。黏著斑蛋白表達水平在宰后3 h與宰后3、9、12 h的pH值呈顯著正相關（P＜0.05），在宰后9 h和12 h與宰后3 h的pH值呈顯著正相關（P＜0.05）；宰后3 h的踝蛋白表達水平與宰后9 h的pH值呈顯著負相關（P＜0.05）。

2.4 PLSR分析結果

圖4 pH值和整聯蛋白、黏著斑蛋白和踝蛋白表達水平與汁液流失率的PLS1模型分析Fig.4 Regression coefficient of the PLS1 model explaining variance in drip loss versus pH and expression levels of integrin, vinculin and talin

為探究pH值和骨架蛋白與汁液流失率的關系，將各時間點的pH值和骨架蛋白表達水平與汁液流失率建立PLS1回歸模型。如圖4所示，汁液流失率與各時間點的pH值都呈顯著負相關，與宰后3、9 h和24 h的整聯蛋白表達水平呈顯著負相關，與宰后3 h和9 h的黏著斑蛋白表達水平呈顯著負相關，與宰后45 min～24 h 的踝蛋白表達水平呈顯著正相關（P＜0.05）。說明宰后豬肉中pH值的降低、整聯蛋白和黏著斑蛋白的降解會增加汁液流失，而踝蛋白的降解有利于減少汁液流失。Brewer[2]也認為，高持水性的肉具有較高的pH值，pH值的變化以及整聯蛋白、黏著斑蛋白和踝蛋白等骨架蛋白的降解會對持水性產生影響；Zhang Wangang等[28]的研究表明宰后1 d的整聯蛋白表達水平與汁液流失率呈顯著負相關（P＜0.05）；Bee等[6]的研究表明，pH值與汁液流失率呈負相關（宰后45 min和6 h的pH值與汁液流失率的相關系數分別為-0.49和-0.56），在宰后24 h，黏著斑蛋白表達水平與汁液流失率呈顯著負相關，踝蛋白表達水平與汁液流失率呈顯著正相關（P＜0.05），且pH值的降低會影響踝蛋白的降解，與本研究結果一致。

對變量與汁液流失率進行PLSR分析，可以簡單得到變量對汁液流失率的直接貢獻。如表2所示，分別對pH值、骨架蛋白表達水平與汁液流失率建立PLS1回歸模型。結果顯示：pH值（模型1）、整聯蛋白表達水平（模型3）、黏著斑蛋白表達水平（模型4）和踝蛋白表達水平（模型5）分別占汁液流失率變異的77%、41%、44%和34%。

表2 測量參數（X變量）分別解釋汁液流失率（Y變量）方差的PLS1模型Table 2 Figures of merit of PLS1 models for each independent variable to explain variance in drip loss

為進一步明晰pH值和3 種骨架蛋白在何時對汁液流失率的直接貢獻較大，將各時間點的pH值與汁液流失率建立PLS1回歸模型1，排除不顯著變量后繼續(xù)建立PLS1回歸模型2，該模型主要由宰后45 min的pH值控制，且占汁液流失率變異的66%，說明宰后45 min的pH值對汁液流失率的影響較大；將3 種骨架蛋白表達水平與汁液流失率建立PLS1回歸模型6，排除不顯著變量后繼續(xù)建立PLS1回歸模型7，該模型主要由宰后9 h的整聯蛋白表達水平控制，且占汁液流失率變異的72%，說明在3 種骨架蛋白中，宰后9 h的整聯蛋白表達水平對汁液流失率的影響較大。

3 討 論

基于宰后45 min豬背最長肌的pH值對其進行分組后，高pH組的pH值在宰后12 h內極顯著高于低pH組（P＜0.01）（圖3A）；高pH組的汁液流失率極顯著小于低pH組（P＜0.01）（圖2）；宰后45 min～24 h的pH值與汁液流失率呈顯著負相關（P＜0.05）（圖4）。說明pH值越低，豬肉的持水性越差。此結果與謝華等[29]的研究一致。魏心如等[30]通過相關性分析也發(fā)現宰后24 h的pH值與壓榨損失率和滴水損失率均呈顯著負相關（P＜0.05），指出提高pH值有助于保持冷卻雞肉的持水性。最近Watanabe等[31]的研究也表明pH值是影響豬肉持水性最重要的因素之一，與汁液流失率呈極顯著負相關（P＜0.01）。

在宰后45 min～24 h，高pH組的整聯蛋白和黏著斑蛋白表達水平高于低pH組，踝蛋白表達水平低于低pH組，且高pH組的整聯蛋白和黏著斑蛋白降解速率較低pH組慢，踝蛋白降解速率較低pH組快（圖3B～D）。pH值與整聯蛋白和黏著斑蛋白表達水平整體呈正相關性，與踝蛋白表達水平整體呈負相關性（表1）。說明pH值降低越快，整聯蛋白和黏著斑蛋白的降解越多，踝蛋白降解越少。Brewer[2]和Lonergan[32]等也認為pH值會通過調節(jié)鈣蛋白酶的活性從而影響骨架蛋白降解。

在所研究的骨架蛋白中，9 h的整聯蛋白表達水平對汁液流失率的影響最大（表2，模型7）。這可以從Lawson[9]和Zhang Wangang[28]等的研究中得到解釋：由于整聯蛋白的特殊位置，當整聯蛋白降解時，膜和黏附結構被破壞，肌細胞/膜之間的相互作用減弱，形成汁液流失通道，增加汁液流失。因此，完整的整聯蛋白能起到阻止汁液流失通道開放、減少宰后豬肉汁液流失的作用。但pH值的降低比骨架蛋白降解對持水性的影響更大。因為pH值的變化會影響骨架蛋白的降解，且在圖4多變量模型中各時間點的pH值都對汁液流失率產生較大的負作用，并單獨解釋了汁液流失率變異的77%（表2，模型1），大于骨架蛋白對汁液流失率的貢獻。考慮到簡單實用性和預測準確性，宰后45 min的pH值可以作為宰后豬肉汁液流失率的預測指標。因為單獨對pH值與汁液流失率進行PLS1回歸分析，剔除不顯著變量后只有宰后45 min的pH值對汁液流失率有顯著影響（表2，模型2）。Hamoen等[33]的研究也表明pH值是預測宰后肉品質的可靠指標。Sch?fer等[16]的研究表明pH值可以解釋汁液流失率變異的85%，宰后2 h內的pH值可以用于預測汁液流失率。

綜上，宰后豬肉中pH值的高低會通過影響細胞骨架完整性，進而影響最終產品的持水性。pH值的降低對豬肉持水性的影響較骨架蛋白降解影響更大，且宰后45 min的pH值可以用于預測宰后豬肉汁液流失率。