張春寧，李超明，李明堯，林華明

廣東省茂名市人民醫(yī)院腫瘤科，茂名 525000

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占全部肺癌病例80%以上，且發(fā)病率呈逐年增加趨勢[1]。NSCLC的主要治療方式為手術(shù)治療，但部分處于中晚期的患者在確診時已喪失手術(shù)機(jī)會，常需要放化療，旨在殺死殘余的腫瘤細(xì)胞，延長患者生存時間及提高生存質(zhì)量[2]。盡管如此，受困于藥物不良反應(yīng)和耐藥性，中晚期肺癌患者病情進(jìn)展迅速，療效并不理想[3]。微創(chuàng)冷凍消融治療是通過氬氦刀，在腫瘤局部釋放超低溫，以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法[4]。微創(chuàng)冷凍消融術(shù)在原發(fā)性肝癌[5]、軟組織肉瘤[6]、滑膜肉瘤[7]及胃癌肝轉(zhuǎn)移[8]患者的治療中均有臨床應(yīng)用。本研究旨在探討微創(chuàng)冷凍消融術(shù)對中晚期NSCLC患者腫瘤標(biāo)志物、免疫功能及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇及分組

納入2017年1月至2018年1月在茂名市人民醫(yī)院腫瘤科確診為中晚期NSCLC的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)肺部CT、臨床表現(xiàn)、肺癌標(biāo)志物及病理檢查確診為NSCLC的患者；②不能接受手術(shù)切除治療，且TNM分期(第七版)為Ⅲb或Ⅳ期的患者；③心、肝、腎功能可耐受冷凍消融治療；④經(jīng)Karnofsky評分，結(jié)果≥70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者存在意識障礙、癡呆、精神障礙；②伴有嚴(yán)重內(nèi)科疾患及感染?；颊叻譃槁?lián)合治療組和單純化療組，其中聯(lián)合治療組共45例，接受微創(chuàng)冷凍消融術(shù)+化療，單純化療組共56例，僅接受化療。本研究征得茂名市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。

1.2 治療方案

聯(lián)合治療組行微創(chuàng)冷凍消融術(shù)+化療。微創(chuàng)冷凍消融術(shù)方法：患者消毒鋪巾后，行CT掃描確定腫瘤的大小和體積，設(shè)計好進(jìn)針入路，術(shù)前先讓患者舌下含服2片可待因，再經(jīng)2%利多卡因局麻后，確定角度、深度及方向后穿刺進(jìn)針，到達(dá)靶點(diǎn)后，啟動超低溫冷凍系統(tǒng)，隨后速降溫度至-150℃～-130℃，維持15 min，待冰球覆蓋腫瘤大小后，氦氣復(fù)溫至15℃，重復(fù)上述循環(huán)，拔出氬氦刀，加壓包扎，對于腫瘤偏大，一次微創(chuàng)冷凍消融冰球無法全部覆蓋的腫瘤，給予多針微創(chuàng)冷凍消融。監(jiān)測有無并發(fā)癥及生命體征。單純化療組僅給予藥物治療，其中鱗癌化療方案為紫杉醇+順鉑，腺癌化療方案為培美曲塞+順鉑。微創(chuàng)冷凍消融術(shù)后靶向藥物的使用均根據(jù)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變情況決定，EGFR突變型采用吉非替尼分子靶向藥物治療，EGFR野生型不給予吉非替尼分子靶向藥物。

1.3 觀察指標(biāo)

①血清學(xué)指標(biāo)：在接受微創(chuàng)冷凍消融術(shù)治療前1天和治療后1個月，分別采集兩組患者外周血5 mL，保存于-20℃冰箱待測，采用ELISA法測定癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)和細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)濃度。②免疫功能指標(biāo)包括T淋巴細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞檢測。外周血T淋巴細(xì)胞檢測：在待測的外周靜脈血中，加入20 μL CD4、CD8、CD3抗體(美國BD生物公司)，加入細(xì)胞裂解液裂解10 min，離心5 min，棄上清，再行流式細(xì)胞儀檢測；調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)檢測：取100 μL靜脈血，加入CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)單抗、CD25-FITC單抗，細(xì)胞裂解液裂解后，取上清，再行流式細(xì)胞儀檢測。③腫瘤反應(yīng)評價：評價標(biāo)準(zhǔn)采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)[9]，療效包括4類，即完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)。總有效率=(CR+PR)例數(shù)/總例數(shù)×100%。④整體生存情況：治療后2年內(nèi)，隨訪兩組患者的病情變化情況，計算中位總生存期和總生存率。

1.4 隨訪方法

采用門診和電話隨訪相結(jié)合的方式，每3～6個月隨訪1次，中位隨訪期15個月，隨訪截止時間2020年6月，隨訪內(nèi)容包括患者生存情況。共失訪3例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

符合正態(tài)分布的計量資料采用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料，采用中位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料組間比較，采用卡方檢驗。統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS 19.0版，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況比較

兩組患者性別、年齡、病理類型、TNM分期、腫瘤位置及腫瘤大小比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。聯(lián)合治療組EGFR突變有22例(48.9%)，單純化療組有28例(50%)，對于EGFR突變者給予吉非替尼治療，見表1。

表1 聯(lián)合治療組與單純化療組患者一般情況比較Table 1 Comparison of general conditions of patients in combined treatment group and chemotherapy alone group

2.2 兩組療效的比較

微創(chuàng)冷凍消融術(shù)后，腫瘤形成冰球，隨訪腫瘤體積變小，壞死并形成空腔，見圖1。微創(chuàng)冷凍消融術(shù)后1月，聯(lián)合治療組CR 0例、PR 20例、SD 4例、PD 21例，總有效率為44.4%(20/45)；單純化療組CR 0例、PR 10例、SD 6例、PD 40例，總有效率為17.9%(10/56)，聯(lián)合治療組總有效率高于單純化療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：胸部CT顯示右上葉一個1.5 cm大小結(jié)節(jié)；B：CT引導(dǎo)下冷凍探針形成冰球覆蓋腫瘤；C：CT掃描示腫瘤消退，空腔形成圖1 NSCLC患者接受微創(chuàng)冷凍治療術(shù)前后CT圖Fig.1 CT images of NSCLC patients before and after minimally invasive cryoablation therapy

2.3 治療前后兩組患者血清腫瘤標(biāo)志物比較

聯(lián)合治療組和單純化療組患者在治療前血清腫瘤標(biāo)志物CEA、SCCA和Cyfra21-1濃度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，經(jīng)微創(chuàng)冷凍消融術(shù)治療1月后，聯(lián)合治療組血清腫瘤標(biāo)志物CEA、SCCA和Cyfra21-1濃度低于單純化療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

2.4 兩組患者治療前后機(jī)體免疫功能的比較

兩組患者在治療前外周血中CD3+(%)、CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)、CD4+/CD8+比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，微創(chuàng)冷凍消融術(shù)治療1月后，聯(lián)合治療組血清中CD3+(%)、CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)、CD4+/CD8+均高于單純化療組(均P<0.05)，見表3。

2.5 兩組患者治療前后機(jī)體Treg細(xì)胞水平比較

治療前，聯(lián)合治療組和單純化療組外周血中CD4+CD25+(%)和CD4+CD25+/CD4+比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，經(jīng)微創(chuàng)冷凍消融術(shù)治療1月后，聯(lián)合治療組CD4+CD25+(%)和CD4+CD25+/CD4+均低于單純化療組(P<0.05)，見表4。

表2 聯(lián)合治療組與單純化療組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物的比較Table 2 Comparison of serum tumor markers between combined therapy group and chemotherapy alone group before and after treatment

表3 聯(lián)合治療組與單純化療組患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞水平的比較Table 3 Comparison of peripheral blood T lymphocyte levels between combined therapy group and chemotherapy alone group before and after

表4 聯(lián)合治療組與單純化療組患者治療前后外周血Treg細(xì)胞水平比較Table 4 Comparison of Treg cell levels in peripheral blood of patients in combined therapy group and chemotherapy alone group before and after treatment

2.6 聯(lián)合治療組與單純化療組中位生存時間和總生存率比較

生存曲線分析示，聯(lián)合治療組與單純化療組的中位生存時間分別為12.9個月和7.5個月，1年生存率分別為53.6%和35.4%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-Rank=10.68，P<0.01)，見圖2。

圖2 聯(lián)合治療組與單純化療組患者生存曲線比較Fig.2 Comparison of survival curve between combined treatment group and chemotherapy alone group

3 討論

肺癌是致死率排第1位的惡性腫瘤，早期肺癌經(jīng)手術(shù)切除后可達(dá)到根治的目的[9]，令人遺憾的是大部分肺癌患者診斷時就處于中晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會而導(dǎo)致5年生存率不足15%，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[10]。中晚期無法手術(shù)治療的肺癌患者治療方法為放化療聯(lián)合分子靶向治療。盡管如此，由于放化療的耐藥性和多種并發(fā)癥，患者預(yù)后仍不理想。近年來，冷凍療法逐步用于治療肺部惡性病變，例如經(jīng)皮冷凍手術(shù)是治療晚期肺癌的選擇之一[11]。目前認(rèn)為缺乏手術(shù)指征的晚期患者和可能出現(xiàn)致命并發(fā)癥而不能手術(shù)的肺癌患者均可采用冷凍療法，氦氣刀冷凍消融術(shù)是冷凍治療的一種，是局部腫瘤微創(chuàng)治療手段，其主要通過細(xì)胞和血管損傷對腫瘤組織產(chǎn)生破壞效應(yīng)[12]。氬氦刀應(yīng)用于腫瘤治療已有報道，李靜等[6]報道氬氦刀冷凍消融術(shù)可用于軟組織肉瘤的治療，且患者耐受較好，不良反應(yīng)較少。張永遠(yuǎn)等[7]報道CT引導(dǎo)下氬氦刀冷凍消融可用于滑膜肉瘤的治療，且臨床緩解效果較好，安全性佳。常旭等[8]報道氬氦刀冷凍消融在對胃癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤局部控制率、總生存率及無進(jìn)展生存指標(biāo)上均有較好的效果。

血清腫瘤標(biāo)志物常用于診斷惡性腫瘤，并有助于病情判斷。CEA、SCCA及Cyfra21-1均是肺癌的腫瘤標(biāo)志物，CEA濃度隨腫瘤進(jìn)展而升高，但特異性較低。SCCA是鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原，在鱗狀細(xì)胞癌患者血清中大量存在。而Cyfra21-1全稱為角蛋白19的可溶性片段，其起源于上皮細(xì)胞源性腫瘤，并分泌進(jìn)入血循環(huán)中[13]。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組患者在冷凍消融術(shù)后1月血清腫瘤標(biāo)志物CEA、SCCA和Cyfra21-1濃度均低于單純化療組，顯示經(jīng)冷凍消融術(shù)治療的患者腫瘤釋放至血清中的腫瘤標(biāo)志物濃度顯著降低，其可能原因為氦氣刀所產(chǎn)生的冷凍效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤組織發(fā)生不可逆性壞死，大量腫瘤細(xì)胞被消滅，產(chǎn)生減瘤效應(yīng)，機(jī)體腫瘤負(fù)荷降低，從而導(dǎo)致血清中腫瘤標(biāo)志物水平顯著降低。

本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組在冷凍消融術(shù)治療后1月血清中免疫功能相關(guān)指標(biāo)CD3+(%)、CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)、CD4+/CD8+均顯著高于單純化療組，提示經(jīng)過冷凍消融術(shù)后患者體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能較單純化療組提高。大量研究顯示T淋巴細(xì)胞是腫瘤免疫的重要組成部分，其中CD3+T淋巴細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞免疫清除中起關(guān)鍵作用，CD4+T淋巴細(xì)胞是主要的輔助性T細(xì)胞，其除了發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用外，尚存在免疫記憶功能，可發(fā)揮機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的再次免疫，CD8+T淋巴細(xì)胞為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，其對腫瘤免疫應(yīng)答具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在T淋巴細(xì)胞亞群中，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞常用于自身免疫功能的評估，可調(diào)節(jié)腫瘤免疫狀態(tài)[14]。CD4+CD25+T細(xì)胞在自身免疫耐受及免疫逃逸中扮演著重要作用[15]。Treg細(xì)胞則可下調(diào)免疫共刺激及粘附分子的表達(dá)，對抑制性細(xì)胞因子具有促進(jìn)作用，抑制自身免疫反應(yīng)[16]。與腫瘤細(xì)胞活躍程度密切相關(guān)的則是Treg細(xì)胞，其數(shù)量與腫瘤細(xì)胞增殖成正比，并可用于腫瘤預(yù)后判斷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍消融治療后的患者CD4+CD25+(%)水平及CD4+CD25+/CD4+均比治療前低，且治療后聯(lián)合治療組低于單純化療組，表明冷凍消融術(shù)對腫瘤細(xì)胞增殖速度具有一定的延緩作用，并可促進(jìn)清除腫瘤細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)接受冷凍消融術(shù)患者的臨床療效優(yōu)于接受單純化療的患者，主要表現(xiàn)在聯(lián)合治療組總有效率高于單純化療組(44.4%vs. 17.9%，P<0.05)。誠然，單純化療組總有效率在17.9%，低于文獻(xiàn)報道[18]的30%，其原因可能與本研究所納入的患者TNM分期均為Ⅲb及Ⅳ期，沒有納入早中期患者有關(guān)，而其他文獻(xiàn)所納入的TNM早中期患者較多，這可歸因于一定的選擇偏倚。同時聯(lián)合治療組與單純化療組的中位生存時間分別為12.9個月和7.5個月，1年生存率分別為53.6%和35.4%。文獻(xiàn)報道[18]在一項大樣本研究中，對840例NSCLC患者(Ⅱa～Ⅳ期)進(jìn)行冷凍治療后，NSCLC患者腫瘤體積縮小后空腔形成，其中完全緩解和部分緩解患者分別為86例(14.4%)和588例(70%)，該研究認(rèn)為接受微創(chuàng)冷凍治療的患者生存率高于化療或化療聯(lián)合放射治療患者，且平均總生存期為23個月。在本研究中也可發(fā)現(xiàn)接受微創(chuàng)冷凍治療的患者在腫瘤結(jié)節(jié)部位形成冰球，并且完全覆蓋腫瘤部位，在隨訪過程中腫瘤體積變小而逐步消退，腫瘤部位空腔形成。

微創(chuàng)冷凍消融術(shù)治療晚期癌癥的機(jī)制主要體現(xiàn)在以下幾個方面：首先，氬氦刀瞬間降溫引起的冷凍效應(yīng)會引起腫瘤組織壞死，從而降低機(jī)體腫瘤負(fù)荷[19]，本研究中發(fā)現(xiàn)血清腫瘤標(biāo)志物CEA、SCCA和Cyfra21-1濃度顯著降低也證實上述機(jī)制；其次，微創(chuàng)冷凍治療可促進(jìn)機(jī)體對腫瘤的免疫應(yīng)答能力[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)冷凍消融術(shù)后患者細(xì)胞免疫功能較單純化療組顯著增強(qiáng)。

總之，微創(chuàng)冷凍消融術(shù)治療中晚期NSCLC較單純化療能顯著降低患者血清腫瘤標(biāo)志物水平，提高T細(xì)胞的免疫功能，具有較好的治療效果。