吳曉婷，費(fèi)素娟，李 莉

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 徐州 221000)

食管癌是臨床上較為常見的腫瘤之一，食管鱗狀細(xì)胞癌占食管癌病理組織類型的90%以上，我國每年因食管癌死亡人數(shù)在20萬以上，多數(shù)患者因確診時(shí)已為晚期，因此預(yù)后較差，5年生存率僅有30%左右[1,2]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對腫瘤免疫學(xué)認(rèn)知進(jìn)一步加深，免疫治療成為了研究的熱點(diǎn)。PD-L1是共刺激分子家族的一個成員，具有抑制T淋巴細(xì)胞活化的作用，在黑色素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，可作為免疫治療的一個靶點(diǎn)[3-5]。有研究顯示PD-L1基因多態(tài)性與腫瘤生物學(xué)特征有關(guān)，但關(guān)于PD-L1基因多態(tài)性與食管癌的研究較少[6，7]?；诖耍敬芜x擇PD-L1基因不同位點(diǎn)rs2890658、rs17718883、rs2297136以及rs4143185單核苷酸多態(tài)性對食管癌患者病理特征及預(yù)后的影響進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年1月我院診治的食管癌患者86例作為食管癌組，同期選取100例體檢者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀察組患者均經(jīng)過病理組織學(xué)確診；(2)能夠獲得完整臨床標(biāo)本；(3)對照組無腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病病史；(4)同意加入本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料缺失；(2)合并其他系統(tǒng)腫瘤；(3)入組前接受免疫治療或者抗腫瘤治療。本次研究已經(jīng)在我院倫理委員會備案并獲得批準(zhǔn)，所有入組樣本簽署知情同意書。

1.2 方法

在GenBank數(shù)據(jù)庫檢索PD-L1基因，提取PD-L1不同位點(diǎn)rs2890658、rs17718883、rs2297136以及rs4143185的基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)基因引物序列，見表1。所有患者均在入院后收集外周靜脈血標(biāo)本，放于-80℃冰箱中儲存，PD-L1不同位點(diǎn)rs2890658、rs17718883、rs2297136以及rs4143185的基因測序由北京博奧生物有限公司完成。

表1 PD-L1不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性引物序列

1.3 觀察指標(biāo)

(1)對比食管癌患者與對照組PD-L1基因不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性表達(dá)情況。(2)以不同基因位點(diǎn)基因型的不同類型分類，野生型(純合野生型)及突變型(雜合突變型和純合突變型)，分析PD-L1基因不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與食管癌病理類型、大小、部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度的關(guān)系。(3)分析PD-L1基因不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性對食管癌患者預(yù)后質(zhì)量的影響。

1.4 隨訪

采用門診、微信、電話等隨訪方式對患者進(jìn)行隨訪，記錄患者相關(guān)事件情況。隨訪時(shí)間為30～66個月，隨訪時(shí)間中位數(shù)為47個月，隨訪時(shí)間截止在2019年6月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較

觀察組1例患者因家屬拒絕繼續(xù)治療，未取得完整資料，1例患者因在研究中確診并發(fā)肝癌，最終完成研究84例。對照組中1例在體檢后6個月內(nèi)確診胃癌，最終納入研究99例。兩組在性別、年齡、腫瘤家族史以及體重指數(shù)方面對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組基線資料對比

2.2 對照組PD-L1基因不同位點(diǎn)多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

對照組PD-L1基因不同位點(diǎn)多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，rs4143185不具有群體代表性(P<0.05)，rs17718883、rs2890658、rs2297136結(jié)果具有群體代表性(P>0.05)，見表3。

表3 對照組PD-L1基因不同位點(diǎn)多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)[ n(%)]

2.3 兩組PD-L1不同基因位點(diǎn)基因型對比

觀察組與對照組在PD-L1不同基因位點(diǎn)基因型頻率比較結(jié)果顯示，rs17718883、rs2890658、rs2297136基因位點(diǎn)對比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組PD-L1基因多態(tài)性基因型頻率對比[ n(%)]

2.4 食管癌患者PD-L1基因多態(tài)性與食管癌患者臨床病理特征關(guān)系

食管癌PD-L1不同基因位點(diǎn)按照野生型和突變型進(jìn)行分組分析，結(jié)果顯示，rs17718883與食管癌患者病理類型、分化程度有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他臨床病理特征無關(guān)(P>0.05)；而rs2890658與食管癌患者分化程度有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他臨床病理特征無關(guān)(P>0.05)；rs2297136與食管癌患者臨床病理特征均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 PD-L1基因多態(tài)性與食管癌患者臨床病理特征關(guān)系

2.5 PD-L1基因多態(tài)性對食管癌患者臨床預(yù)后的影響V對食管癌患者不同基因位點(diǎn)按照野生型和突變型繪制kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，rs17718883與食管癌患者預(yù)后生存有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；rs2890658及rs2297136對食管癌患者預(yù)后生存無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

A:PD-L1基因位點(diǎn)rs17718883生存曲線; B: PD-L1基因位點(diǎn)rs2890658生存曲線; C:PD-L1基因位點(diǎn)rs2297136生存曲線圖1 PD-L1不同基因位點(diǎn)生存曲線Fig 1 Survival curve of different gene loci of PD-L1

2.6 影響食管癌患者預(yù)后因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

對食管癌患者預(yù)后的因素進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果顯示，年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及rs17718883基因型是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 食管癌預(yù)后因素的Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

目前，對于食管癌的治療效果仍然未能使人滿意，隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，免疫治療應(yīng)用在食管癌中具有極為廣闊的前景[8]。PD-1以及PD-L1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，PD-L1由290個氨基酸構(gòu)成，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，其編碼區(qū)域在第9號染色體Cd274上，PD-L1與PD-1結(jié)合后，使T淋巴細(xì)胞釋放抑制性信號，進(jìn)而導(dǎo)致T細(xì)胞喪失免疫活性，無法對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[9，10]。上皮細(xì)胞間質(zhì)化是腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤的主要途徑，是在上皮組織細(xì)胞失去極性，各個細(xì)胞間的黏附連接喪失，從而轉(zhuǎn)變?yōu)橛虚g質(zhì)細(xì)胞功能及形態(tài)的細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞浸潤以及轉(zhuǎn)移，而PD-L1的高表達(dá)會導(dǎo)致機(jī)體上皮細(xì)胞間質(zhì)化發(fā)生，因此也有觀點(diǎn)認(rèn)為PD-L1通過腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞間質(zhì)化發(fā)生免疫逃逸[11，12]。

PD-1/PD-L1是重要的免疫治療靶點(diǎn)，目前針對該通路靶點(diǎn)的藥物主要有Nivolumab以及Pembrolizumab[13]。單核苷酸多態(tài)性是指在一個群體中由于基因中某個位點(diǎn)發(fā)生突變而引起的基因序列多態(tài)性，有研究顯示基因多態(tài)性對腫瘤特征、預(yù)后以及治療效果具有重要影響[14，15]。本次選取的PD-L1基因不同位點(diǎn)rs17718883、rs2890658、rs2297136、rs4143185進(jìn)行分析。

上述研究中，健康人群PD-L1基因位點(diǎn)rs17718883、rs2890658、rs2297136具有群體代表性。食管癌患者與健康人群PD-L1基因多態(tài)性對比，顯示rs17718883、rs2890658、rs2297136具有差異，分析原因可能為PD-L1基因多態(tài)性與食管癌的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)。Zhou等[16，17]研究顯示PD-L1基因rs2890658位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌易感性有關(guān)，支持本研究結(jié)果。

在食管癌PD-L1基因多態(tài)性與臨床病理特征關(guān)系研究中，rs17718883與食管癌患者病理類型、分化程度有關(guān)，rs2890658與食管癌患者分化程度有關(guān)。分析原因可能為在促進(jìn)癌癥細(xì)胞發(fā)生時(shí)，PD-L1就存在不同位點(diǎn)基因多態(tài)性的差異性表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤表現(xiàn)出不同病理特征。Tsutsumi等[18]研究也顯示，PD-L1不同位點(diǎn)的表達(dá)與上皮細(xì)胞間質(zhì)化有關(guān)，幫助食管癌細(xì)胞免疫逃逸并增加其惡性程度，支持本研究結(jié)果。但Steiniche等[19]研究則提示食管癌患者不同的基因表達(dá)譜與病理特征及預(yù)后無關(guān)，與本研究結(jié)果不一致，考慮可能為樣本選擇性偏倚導(dǎo)致，因此在后續(xù)的研究中還需要不斷探索。

kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，rs17718883位點(diǎn)的表達(dá)與食管癌患者預(yù)后有關(guān)，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析也顯示，rs17718883是食管癌預(yù)后的因素。分析原因可能為rs17718883 位于PD-L1基因的編碼區(qū)，rs17718883 CC基因型存在增強(qiáng)PD-L1的作用，使PD-L1抑制細(xì)胞免疫的功能增強(qiáng)，同時(shí)也會增加食管癌細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致預(yù)后較差。而程仕光等[20]在對肝癌的PD-L1多態(tài)性與預(yù)后關(guān)系的研究中，提示rs2890658以及rs4143185與肝癌預(yù)后有關(guān)，與本次結(jié)果有差異，分析原因可能為研究對象不同導(dǎo)致。

綜上所述，在食管癌患者中，PD-L1基因不同位點(diǎn)與正常人存在差異，PD-L1基因rs17718883、rs2890658位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性對病理類型、分化程度有影響，而rs17718883位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性對食管癌患者預(yù)后有影響。