韓慶曄， 公維麗， 史建國， 王丙蓮， 劉慶艾， 蔡 雷， 鄭 嵐，孟慶軍， 楊 艷， 楊俊慧， 馬耀宏

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省科學院生物研究所 山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250103

植酸(肌醇六磷酸)是農(nóng)作物中肌醇和磷酸的主要來源，因單胃動物無法直接利用植酸中的磷酸，造成飼料中需添加無機磷以滿足飼養(yǎng)動物對磷元素的需求，而過剩的無機磷會引起環(huán)境污染和富營養(yǎng)化等嚴重的生態(tài)問題[1,2]。因此，提高單胃動物對飼料中植酸磷的吸收利用以減少磷元素的排放對資源有效利用和減少環(huán)境污染具有重要意義[3]。利用植酸酶(Phytase)作為一種新型飼料添加劑，催化植酸(鹽)水解為肌醇及無機磷酸[4]，以促進動物對微量元素等營養(yǎng)成分的吸收成為解決上述問題的關鍵。

植酸酶主要來源于微生物，當前用于工業(yè)植酸酶生產(chǎn)的菌株大多為單位表達量已較天然菌株大幅度提高的基因工程菌。但對于高密度生產(chǎn)植酸酶的工藝方法主要通過在搖瓶研究的基礎上進行放大。由于工業(yè)生產(chǎn)實際中的發(fā)酵罐不同于實驗室的搖瓶培養(yǎng)，因而常造成搖瓶培養(yǎng)中細胞表達外源蛋白的水平不能準確反映其在發(fā)酵罐中的真實情況。為了可全面了解細胞在反應器中的宏觀生理代謝特性，實現(xiàn)跨尺度觀察與調(diào)控，張明等指出微生物發(fā)酵實質(zhì)上是在分子水平上的遺傳特性、細胞水平上的代謝調(diào)節(jié)和工程水平上的傳遞特性這3個不同水平上發(fā)生調(diào)控的[5]。張嗣良等為此設計了可用于了解細胞生理代謝特性的全參數(shù)檢測生物反應器[6]，該技術已成功應用于青霉素，紅霉素等工業(yè)發(fā)酵工藝的優(yōu)化和規(guī)模放大，實現(xiàn)了工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)效率的提高[7]。莊等亦基于此首次建立了可通過在線生理數(shù)據(jù)計算出實時關鍵參數(shù)的方程式，用來實時監(jiān)測葡萄糖酸鈉(SG)發(fā)酵的實時監(jiān)測方法，使發(fā)酵總產(chǎn)量提升超過16%，顯著提高了SG生產(chǎn)[8]。目前，大量先進的在線生物過程檢測儀表已用于發(fā)酵過程中關鍵代謝特性參數(shù)的采集，并通過參數(shù)之間的對比與相關性分析進行培養(yǎng)過程工藝的優(yōu)化調(diào)控[9]。

本文立足于工程水平上的調(diào)控，基于前期搖瓶研究基礎[10]，對本實驗室自構(gòu)建的植酸酶工程菌在10 L發(fā)酵罐上進行誘導培養(yǎng)，利用多種物理傳感器(pH傳感器、溶氧(DO)傳感器、尾氣分析儀)和生物傳感器(活細胞在線、甘油傳感器、還原糖測定儀、乳酸測定儀)實時檢測改變攪拌速度、接種量與補料甘油三種條件下發(fā)酵液中pH、DO、尾氣中CO2含量(CER)、尾氣中O2含量(OUR)、細胞密度與發(fā)酵液中甘油含量、還原糖含量、乳酸含量等參數(shù)變化，探討植酸酶高密度發(fā)酵下各參數(shù)變化對工程菌細胞生長和產(chǎn)酶的具體影響，并進而通過各參數(shù)變化間相關性分析討論三種發(fā)酵調(diào)控策略在發(fā)酵控制中的具體作用，為工業(yè)上具體操作的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

畢赤酵母GS115產(chǎn)植酸酶工程菌由本實驗室構(gòu)建，-20 ℃保藏。

1.1.2試劑

酵母粉，蛋白胨，無氨基酵母氮源YNB(含硫酸銨)，生物素，丙烯酰胺，N,N,N′,N′-四甲基乙二胺TEMED，十二烷基苯磺酸鈉(SDS)，過硫酸銨，均購買自生工(上海，中國)；葡萄糖，KH2PO4，K2HPO4，甲醇，甘油，釩酸銨，鉬酸銨，硝酸，乙酸，乙酸鈉，購買自國藥(北京，中國)；植酸鈉(Sigma, 美國)

1.1.3培養(yǎng)基

1.1.3.1種子培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10.0，蛋白胨 20.0，葡萄糖 10.0。

1.1.3.2擴大培養(yǎng)基

BMGY培養(yǎng)基(g/L)：YNB 13.4，KH2PO411.8，K2HPO42.9，酵母粉10.0，蛋白胨 10.0，Biotin 4×10-4，甘油10 mL。

1.1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：YNB 13.4，KH2PO411.8，K2HPO42.9，酵母粉10.0，蛋白胨 10.0，Biotin 4×10-4，甲醇5 mL。

1.2 儀器與設備

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀(Bio-rad，美國)，搖床(知楚，上海)，TECAN酶標儀(TECAN，瑞士)，SGD全自動還原糖測定儀(山東省科學院，山東)，SBA-4D型生物傳感分析儀(山東省科學院，山東)，甘油傳感器(山東省科學院，山東)，尾氣傳感分析儀(山東省科學院，山東)，Control Unit EVO 265活細胞在線(FOGALE nanotech，德國)，KRh-BIO 3000型發(fā)酵罐(科潤海，江蘇)，DZFZ-6D型蒸汽發(fā)生器(三星，江蘇)

1.3 方法

1.3.1培養(yǎng)方法

1.3.1.1種子活化

挑取菌種接種于100 mL YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。

1.3.2.2高密度發(fā)酵培養(yǎng)

如表1所示，對相關因素進行設置，將一定量菌體接入10 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中控制攪拌速度以適合菌體生長；維持罐內(nèi)空氣流量在10 L/min；pH控制為6.0；罐溫設置為30 ℃。通過下表操作，探討不同轉(zhuǎn)速、不同接種量和補料甘油對酵母細胞生長和誘導表達植酸酶的影響。表1中批次a～批次d在結(jié)果與討論的圖示中為便于比較，記作a組～d組；與結(jié)論表中批次a～批次d意義相同。

1.3.2.3誘導表達

酵母細胞于擴大培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間后，按日流加1%(v/v)甲醇。定時取樣，探究發(fā)酵期間改變轉(zhuǎn)速、接種量及補料甘油對細胞生長與目的蛋白表達情況的影響(表1)。

1.3.2測定方法

1.3.2.1酵母菌株平板培養(yǎng)方法、搖瓶培養(yǎng)方法、酶液透析方法、蛋白及酶活測定方法、SDS-PAGE檢測蛋白表達方法、還原糖和乳酸含量測定方法以上各測定方法同文獻[10]。

1.3.2.2發(fā)酵液中菌體濃度、溶氧、pH、甘油含量、尾氣中O2與CO2含量的測定

利用活細胞在線測菌體濃度；利用發(fā)酵罐在線控制系統(tǒng)配置的溶氧電極和pH電極檢測溶氧和pH；利用山東省科學院生物研究所研發(fā)的甘油傳感器、尾氣傳感分析儀檢測甘油和尾氣中O2與CO2含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)速控制在植酸酶工程菌細胞生長發(fā)酵中的影響

2.1.1轉(zhuǎn)速對植酸酶工程菌細胞生長的影響

溶氧量( dissolved oxygen content，DO) 是酵母細胞生長過程中最重要的檢測指標之一，它直接影響著酵母細胞的生長和代謝。當O2不足時，菌體的生長就會受到抑制，并代謝產(chǎn)生乳酸[11]。而攪拌器轉(zhuǎn)速與溶氧的變化密切相關[12]。

實驗結(jié)果顯示，在發(fā)酵前20 h，轉(zhuǎn)速均保持在200 r/min，此時兩組細胞密度、溶氧變化無明顯差異(圖1A、B)。b組逐步提高轉(zhuǎn)速，細胞密度在發(fā)酵36 h～50 h增至最高達4.25 pF/cm(圖1 A)，因菌體代謝伴有極高的耗氧與CO2的釋放，致使溶氧降至最低，尾氣中O2含量降至最低(圖1 D)，CO2含量升至最高(圖1 E)。細胞密度最高時，受此時溶氧的限制，伴有乳酸短時升高(圖1 C)。發(fā)酵50 h后隨著甲醇流加，細胞密度開始降低，溶氧升高，尾氣中O2含量增加，CO2含量降低；發(fā)酵60 h后，各參數(shù)趨于平穩(wěn)。而a組細胞密度低于b組(圖1 A)，由于轉(zhuǎn)速低，攪拌不均質(zhì)，O2與CO2濃度在發(fā)酵過程中無明顯變化，乳酸變化亦不明顯。因此，保證持續(xù)通氧的情況下，相應調(diào)整攪拌器轉(zhuǎn)速，有利于提高菌體細胞密度。

圖1 在不同攪拌器轉(zhuǎn)速控制條件下活細胞密度、DO、乳酸及尾氣中O2與CO2濃度的變化曲線

2.1.2轉(zhuǎn)速對植酸酶工程菌細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在菌體表達蛋白的過程中pH變化明顯。當pH值穩(wěn)定在3.5時，蛋白表達出現(xiàn)的時間與pH變化趨于穩(wěn)定的時間相近(圖2 A)。a組菌體24 h培養(yǎng)后經(jīng)甲醇誘導，于發(fā)酵66 h后有明顯目的蛋白出現(xiàn)并累積(圖2 E)，最高酶活為991.05 U/mL(圖2 B-a)；整體還原糖含量基本穩(wěn)定(圖2 C)；相同誘導條件與時間，b組于發(fā)酵42 h后表達蛋白(圖2 F)，時間縮短24 h，且酶活提高44.9%，達到1 436.09 U/mL(圖2 B-b)。因此，提高轉(zhuǎn)速利于改善發(fā)酵溶氧條件，促使菌體利用甘油進行生長(圖2 D)，并有利于后期蛋白的表達。

9：細胞培養(yǎng)24 h,開始流加甲醇; 10-29：每隔6 h取樣檢測

2.2 接種量對植酸酶工程菌細胞生長發(fā)酵的影響

2.2.1接種量對植酸酶工程菌細胞生長的影響

實驗結(jié)果顯示，按1%、10%的接種量進行發(fā)酵，10%接種量能有效縮短發(fā)酵時間。

發(fā)酵前7 h，由于c組接種量大，細胞對氧的利用高于b組，溶氧先于b組降低；受攪拌影響，細胞密度略低于b組(圖3 A)。發(fā)酵24 h，細胞生長進入穩(wěn)定期，溶氧降至最低(圖3 B)，尾氣中O2含量開始降低，CO2含量升高；發(fā)酵36 h，此時尾氣中O2含量降至最低(圖3 D)，CO2含量升至最高(圖3 E)，此階段伴有乳酸升高(圖3 C)。比較b組得出：在通氧充足的條件下，發(fā)酵前期升高轉(zhuǎn)速，菌體生長，細胞密度升高使發(fā)酵液中溶氧降低，尾氣中O2含量降低與CO2含量升高。穩(wěn)定期流加甲醇，細胞密度趨于平穩(wěn)，菌體吸收甲醇作為碳源，由于甲醇具有一定的毒害作用，致使細胞密度下降，溶氧升高，尾氣中O2含量降低與CO2含量升高；此間降低轉(zhuǎn)速，可使細胞密度適當恢復，出現(xiàn)溶氧降低，尾氣中O2含量降低，CO2含量升高的情況。其中溶氧與尾氣的檢測可直接反應出菌體的生長狀況，乳酸可提示菌體進行對數(shù)生長。

圖3 不同接種量條件下活細胞密度、DO、乳酸及尾氣中O2與CO2濃度的變化曲線

2.2.2接種量對植酸酶工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由實驗結(jié)果得出，10%接種量使植酸酶表達提前；細胞密度升高的同時，使植酸酶得到明顯積累。c組發(fā)酵末期酶活可達3037.98 U/mL(圖4 A)，相較b組酶活提高111.5%；pH上，c組提前處于表達蛋白階段(圖4 C)，此間還原糖含量基本不變(圖4 D)；SDS-PAGE檢測結(jié)果也可表明c組植酸酶表達時間(圖4 F)的提前。

11：細胞培養(yǎng)24 h,開始流加甲醇; 12-25：每6 h取樣檢測

2.3 甘油補料對植酸酶工程菌細胞生長發(fā)酵的影響

2.3.1甘油補料對植酸酶工程菌細胞生長的影響

在菌體到達穩(wěn)定期之前，提升穩(wěn)定菌體含量對后期目的蛋白的高效表達具有一定影響。通過對前期補料甘油來探討此時菌體生長情況與對蛋白表達的影響。

按10%接種量，轉(zhuǎn)速逐步增加，待培養(yǎng)至18 h，d組補料1%(v/v)的甘油。結(jié)果顯示，發(fā)酵前18 h，由于細胞整體活度的影響，造成前期溶氧的利用并不完全一致(圖5 B)；發(fā)酵18 h，d組補料甘油；20 h乳酸升至最高(圖5 C)，由于甘油的添加，造成發(fā)酵液黏度上升，乳酸的峰值較c組有所延遲；發(fā)酵24 h，d組細胞密度升至最高；發(fā)酵31 h，尾氣中O2含量明顯降低、CO2含量升高(圖5 D、E)；此后，d組細胞密度開始降低。甘油的添加一方面易造成發(fā)酵液黏度升高，使菌體對溶氧的利用受到限制；另一方面可穩(wěn)定細胞量，延緩細胞因營養(yǎng)不足而導致的過早衰亡，并維持細胞較高的溶氧消耗，提高細胞活度(圖5 B)。

圖5 不同甘油補料條件下活細胞密度、DO、乳酸及尾氣中O2與CO2濃度的變化曲線

2.3.2補料甘油對植酸酶工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由實驗結(jié)果可知：前期補料甘油，d組酶活在發(fā)酵末期可達到2216.33 U/mL(圖6 A)，相較于c組酶活降低27%；從pH變化時間上看d組有所延后(圖6 B-d)；從甘油、還原糖含量可看出d組中菌體利用甘油進行生長(圖6 C、D)，至發(fā)酵后期，還原糖含量有所降低(圖6 D)。

5：細胞培養(yǎng)24 h,開始流加甲醇; 12：流加甲醇后5 h

從SDS-PAGE檢測結(jié)果中可以看出：d組自發(fā)酵33 h流加甲醇至發(fā)酵42 h后植酸酶開始表達，較于c組自發(fā)酵24 h流加甲醇至發(fā)酵27 h即有植酸酶表達延遲6 h。在甘油與甲醇并存的前提下，菌體優(yōu)先利用甘油、補充碳源進行生長，推測前期甘油的不完全利用對于后期蛋白表達具有一定的遲滯作用。

3 總結(jié)與討論

通過四次發(fā)酵(如表1所示)探得：對植酸酶工程菌以流加甲醇含量為1%，培養(yǎng)溫度為30 ℃的情況下，接種量為10%，其發(fā)酵遲滯期最短且蛋白表達量最高，末期可達3 037.98 U/mL，此時生長pH為5.0，產(chǎn)酶的pH為3.5。

本文基于罐體培養(yǎng)，結(jié)合多種在線傳感器，著重分析轉(zhuǎn)速、細胞密度、溶氧和尾氣中氧氣與二氧化碳含量的關系，結(jié)合其他發(fā)酵指標，結(jié)果得到(如表2，表3所示)：(1) 轉(zhuǎn)速影響溶氧和細胞密度，且在發(fā)酵前期，轉(zhuǎn)速提高，細胞密度增加，罐內(nèi)溶氧降低，尾氣中O2含量降低，CO2含量升高；菌體平穩(wěn)后，轉(zhuǎn)速提高，細胞密度下降，罐內(nèi)溶氧升高，尾氣中O2含量升高，CO2含量降低。其中當CO2排放(CER)達到最值時，與細胞密度或菌體量增至最值時的時間相吻合，此時發(fā)酵液pH變化趨于平穩(wěn)，且目的蛋白也開始表達。(2) 溶氧和乳酸開始變化與達到最值且平穩(wěn)的時間基本吻合；乳酸可作為發(fā)酵環(huán)境中溶氧是否充足的指標。

表2 不同發(fā)酵批次各參數(shù)指標變化時間(一)

表3 不同發(fā)酵批次各參數(shù)指標變化時間(二)

通過四次發(fā)酵結(jié)果，得出如下關系：轉(zhuǎn)速-細胞密度-溶氧-乳酸相關的發(fā)酵罐內(nèi)外環(huán)境氧控制關系；細胞密度-氧氣吸收-二氧化碳釋放相關的細胞生長氧控制關系；細胞密度-二氧化碳釋放-pH變化-蛋白表達的細胞誘導表達的關系。通過罐體培養(yǎng)，以傳感器反饋結(jié)果，建立起實驗室與工業(yè)實踐的關聯(lián)，以期為植酸酶工業(yè)生產(chǎn)做好前期探索。