趙文豪， 田啟文， 唐 維， 吳 晶， 楊 帆，劉 培,2， 賀 帥,2*， 李相前,2*

1.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省益生制劑重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003

水體氮和磷的污染、重金屬污染以及由此造成的水體富營養(yǎng)化問題已成為許多國家以及科學(xué)家共同關(guān)注的問題[1]。早在1957年，就有學(xué)者提出利用藻類培養(yǎng)作為深度生物處理污水的方法，以去除N、P等的營養(yǎng)物質(zhì)[2]。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和工業(yè)化水平的提高，污水排放量日益增長，污染物成分愈發(fā)復(fù)雜，污水排放標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格，水污染成為環(huán)境治理的難題。目前污水處理方法包括化學(xué)法、物理法、活性污泥法和微藻法等[3]。微藻處理法的原理是基于藻類是自養(yǎng)生物，生長過程對污水中有機(jī)質(zhì)要求低，以光作為能源，將氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)合成復(fù)雜的小分子化合物，從而使污水得到凈化[4]。

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，滿足了人們對水產(chǎn)品日益增長的需求[5]。但集約化的養(yǎng)殖過程對水環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，并且高密度養(yǎng)殖期間氨氮、亞硝態(tài)氮含量的超標(biāo)，引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫力下降，導(dǎo)致疾病的爆發(fā)[6,7]。同時(shí)養(yǎng)殖污水的肆意排放更是對附近生態(tài)平衡造成嚴(yán)重的危害，由此衍生的水產(chǎn)養(yǎng)殖污染問題日益顯著[8,9]。因此，有效降低養(yǎng)殖水體中有害物質(zhì)含量、改善養(yǎng)殖環(huán)境、防治養(yǎng)殖疾病備受科研界關(guān)注[10,11]。微藻是一類廣泛存在于海洋和陸地上的、低等的、可利用光合作用的藻類微生物總稱[12]。單細(xì)胞微藻能夠以光照為能源，利用水中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行光合作用，合成自身生長所需有機(jī)物質(zhì)[13-15]。使用微藻處理養(yǎng)殖污水不僅安全、環(huán)保，而且微藻可以作為魚蝦的理想餌料。因此微藻生物防治的特性成為目前研究熱點(diǎn)[16,17]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，根據(jù)三株小球藻在不同濃度的氨氮和亞硝態(tài)氮為唯一氮源的模擬污水中的生長情況，探究其對氨氮和亞硝態(tài)氮的去除能力。研究結(jié)果對于小球藻處理污水、凈化水資源具有一定現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

本實(shí)驗(yàn)所有小球藻CV315-1(Chlorellasp.)、小球藻CV315-2(Chlorellasorokiniana)和小球藻CV315-3(Chlorellapyrenoidosa)均選自于淮陰工學(xué)院益生制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫。

1.2 培養(yǎng)基成分

實(shí)驗(yàn)采用的是改良后BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值為7.1，且培養(yǎng)基、微量元素母液均由去離子水配制。培養(yǎng)基及微量元素母液配方如表1和表2所示。試劑純度均為分析純(AR)，下述所有實(shí)驗(yàn)試劑全部購自上海生工生物有限公司。

表1 BG11培養(yǎng)基主要成分

表2 微量元素母液配方

1.3 儀器設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面凈化臺(江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司)、T-6紫外可見分光光度計(jì)(南京菲勒儀器有限公司)、G180T全自動立式高壓滅菌器(河北信騰生物科技有限公司)、5424R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、GRH-400光照培養(yǎng)箱(浙江托普云農(nóng)科技有限公司)。

1.4 藻種制備

將多次劃線純化后的微藻接入已滅菌的BG11液體培養(yǎng)基中，于溫度26 ℃，光照強(qiáng)度8 000 Lux，光暗比為12 h∶12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，達(dá)到對數(shù)生長期后，再轉(zhuǎn)到另一瓶滅菌的BG11液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，如此反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次，使3株微藻均處于對數(shù)生長期。在無菌操作臺上取對數(shù)生長期的藻液，于溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速4 000r/min的超低溫離心機(jī)中離心10 min，棄掉上清液，用改良液體BG11反復(fù)洗滌3次，消除原培養(yǎng)基中氮元素的影響。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 三種藻對氨氮去除特性比較

圖1 模擬污水中CV315-1對不同濃度的去除率(R)及藻液濃度(OD680)變化

圖2 模擬污水中CV315-2對不同濃度的去除率(R)及藻液濃度(OD680)變化

圖3 模擬污水中CV315-3對不同濃度的去除率(R)及藻液濃度(OD680)變化

2.2 三種藻對亞硝態(tài)氮去除特性比較

圖4 模擬污水中CV315-1對不同濃度的去除率(R)及藻液濃度(OD680)變化

圖5 模擬污水中CV315-2對不同濃度的去除率(R)及藻液濃度(OD680)變化

圖6 模擬污水中CV315-3對不同濃度的去除率(R)及藻液濃度(OD680)變化

3 討論

亞硝態(tài)氮對養(yǎng)殖生物具有很大的毒性，高濃度的亞硝態(tài)氮能夠直接抑制菌體的生長，致使水產(chǎn)動物疾病甚至死亡[18]。KUMAR P K等[19]研究微藻對工業(yè)污水的生物修復(fù)作用，發(fā)現(xiàn)微藻能夠利用污水中營養(yǎng)物質(zhì)，在2 d的批量生產(chǎn)模式下去除污水中60%的亞硝酸鹽與30%的氮。ZHENG H L等[20]研究在無糞豬廢水中培養(yǎng)小球藻，發(fā)現(xiàn)廢水中C∶N為25∶1時(shí)小球藻生長效果最佳，并且氨氮的去除率達(dá)到100%。正因小球藻這種獨(dú)特的代謝途徑，因而備受養(yǎng)殖戶青睞。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，CV315-1和CV315-2能夠在168 h內(nèi)完全去除6 mg/L的氨氮，而CV315-3在144 h時(shí)，氨氮濃度為6 mg/L的去除率達(dá)到100%，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程藻液生長良好，結(jié)果表明，三種不同的小球藻中，CV315-3具有更好的氨氮去除能力。CV315-1能夠在48 h內(nèi)完全去除2 mg/L的亞硝態(tài)氮，并且在120 h時(shí)，10 mg/L組亞硝態(tài)氮的去除率達(dá)到100%，而CV315-2和CV315-3在144 h時(shí)完全去除8 mg/L、10 mg/L的亞硝態(tài)氮，結(jié)果表明，三種不同的小球藻中，CV315-1具有更好的亞硝態(tài)氮去除能力。

劉盼等[21]研究蛋白核小球藻和斜生柵藻在14 d內(nèi)對水體中氨氮和亞硝態(tài)氮去除效果，發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻對8 mg/L的氨氮和亞硝氮的去除率最高，分別為82.5%和75.75%，斜生柵藻對4 mg/L的氨氮和0.5 mg/L的亞硝態(tài)氮的去除率最高，分別為86.75%和83.75%。

本研究表明，小球藻能夠有效的減低水體中氨氮和亞硝氮的含量。與已有的研究報(bào)道對比，本研究中所用小球藻CV315-3(Chlorellapyrenoidosa)對于氨氮的去除能力遠(yuǎn)大于劉盼等[21]實(shí)驗(yàn)中的斜生柵藻對于氨氮的去除能力。在對于小球藻對亞硝態(tài)氮去除能力研究中，本實(shí)驗(yàn)中所用小球藻CV315-1(Chlorellasp.)對于亞硝態(tài)氮的去除能力明顯優(yōu)于劉盼等[21]實(shí)驗(yàn)中的蛋白核小球藻、斜生柵藻對于亞硝態(tài)氮的去除能力。

4 結(jié)論

(1) 研究表明CV315-1、CV315-2和CV315-3均能以亞硝態(tài)氮為唯一氮源生長，并且具有良好的去除能力。

(2) CV315-3對氨氮具有良好去除能力，能夠在144 h時(shí)完全去除6 mg/L的氨氮，并且在168 h時(shí)對8 mg/L和10 mg/L組的去除率分別達(dá)到75.6%和56.99%。

(3) CV315-1對亞硝態(tài)氮有高效的去除能力，能夠在48 h時(shí)完全去除2 mg/L的亞硝態(tài)氮，并且在120 h時(shí)完全去除10 mg/L的亞硝態(tài)氮。