劉永龍， 朱禮坪， 黃曉冰， 甘智豪， 黃小茉,3*， 謝小保

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510000；2.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510000；3.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510000

布羅波爾全名為2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇，又名為2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇，是化妝品常用的防腐劑之一[1]。在我國(guó)2015年版的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定，布羅波爾的最高允許添加量為0.01%，還需注意避免形成亞硝胺[2]。布羅波爾屬于高效廣譜的殺菌防腐劑, SHEPHERD J A等人研究發(fā)現(xiàn)，布羅波爾可以通過(guò)釋放出活性氧殺滅大腸桿菌[3]，鄭萍等人研究發(fā)現(xiàn)布羅波爾可在較低的濃度下就可起抑菌作用[4]。故布羅波爾除了在化妝品領(lǐng)域，還在建筑涂料[5]、水產(chǎn)養(yǎng)殖[6]、農(nóng)作物種植[7]和油田工業(yè)[8]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

但是，布羅波爾會(huì)在一定條件下發(fā)生分解[9]，CUI N等人也研究發(fā)現(xiàn)，光照會(huì)促進(jìn)水中布羅波爾的分解[10]，此外布羅波爾還有疑似甲醛釋放物的爭(zhēng)議[11]。以上的這些問(wèn)題，都制約了布羅波爾的應(yīng)用。本文通過(guò)研究布羅波爾在不同的添加量、使用pH、添加溫度、添加后放置時(shí)間和檢測(cè)方法等條件下的穩(wěn)定性，并分析其釋放甲醛的情況，為布羅波爾在化妝品應(yīng)用問(wèn)題提出一些指導(dǎo)意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1主要儀器

HPLC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)、SPD-M20A 230V型光電二極管陣列可見(jiàn)光檢測(cè)器(日本島津公司)、InertSustain C18色譜柱、KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、XW-80A旋渦混合器(上海淇特分析儀器有限公司)、TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、ME204E/02型萬(wàn)分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)、UV752紫外分光光度計(jì)(上海箐華科技儀器有限公司)。

1.1.2試劑

甲醇(色譜純)、超純水、乙腈(色譜純)、二硝基苯肼(分析純)、乙酰丙酮(分析純)、乙酸銨(分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1高效液相色譜法測(cè)定布羅波爾含量

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500 0 g樣品(防腐劑取10 mg)，用10 mL甲醇溶解，經(jīng)過(guò)充分渦旋1 min、超聲40 min、渦旋1 min、離心10 min、經(jīng)過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣5 μL。濾液按表2所示的高效液相色譜法條件，測(cè)定布羅波爾含量。最后用DAD檢測(cè)器檢測(cè)計(jì)算，以面積歸一化結(jié)果報(bào)出數(shù)據(jù)。

表1 高效液相色譜法測(cè)定布羅波爾條件

1.2.2高效液相色譜法測(cè)定甲醛含量

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 0 g二硝基苯肼于試劑瓶中，加入500 mL乙腈(色譜純)，再加3 mL磷酸，搖勻，避光靜置半天后方可使用。

準(zhǔn)確取0.500 0 g樣品(防腐劑取10 mg)于10 mL離心管，用二硝基苯肼衍生劑定容至10 mL，先后經(jīng)過(guò)充分渦旋1 min、超聲40 min、渦旋1 min、離心10 min，最后經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣5 μL。濾液按表2所示的高效液相色譜法條件，測(cè)定甲醛含量。最后用DAD檢測(cè)器檢測(cè)計(jì)算，以面積歸一化結(jié)果報(bào)出數(shù)據(jù)。

表2 高效液相色譜法測(cè)定甲醛條件

1.2.3乙酰丙酮分光光度法測(cè)定甲醛含量

將甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液用水逐級(jí)稀釋到所需濃度(1 mg/L～4 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。然后準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品1.000 0 g于 50 mL 具塞比色管中，加硫酸鈉溶液25 mL，振搖，加水至刻度，于 40 ℃水浴中放置 1 h(其間不時(shí)振搖)。取出快速冷卻，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心(3 000 r/min)，過(guò)濾，將濾液作為待測(cè)溶液。

取待測(cè)溶液 5.00 mL 于 10 mL 具塞比色管中，加乙酰丙酮的乙酸銨溶液5.00 mL，搖勻，于 40 ℃水浴中加熱 30 min，室溫下放置 30 min。另取待測(cè)溶液 5.00 mL，加乙酸銨溶液5.00 mL，搖勻，與前者同法加熱，作為參比溶液。用 1 cm 的比色皿在 414 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，待測(cè)溶液和參比溶液的吸光度之差值作為 A。另取甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液及水各 5.00 mL，分別加入乙酰丙酮的乙酸銨溶液5.00 mL，與樣品同法加熱，冷卻。以水為參比溶液，測(cè)定其吸光度AS及A0。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)布羅波爾穩(wěn)定性和甲醛釋放影響

在pH=7的水溶液中，分別加入0.01%、0.05%和0.1%布羅波爾后，攪拌均勻后，在25 ℃下靜置1 h后，用高效液相色譜法檢測(cè)布羅波爾和甲醛的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同pH下布羅波爾穩(wěn)定性與甲醛釋放情況

不同pH下，布羅波爾穩(wěn)定性如圖1所示。

圖1 不同pH對(duì)布羅波爾穩(wěn)定性影響

圖1顯示了在不同pH下溶液中布羅波爾的含量，結(jié)果表明隨著pH升高，溶液中布羅波爾的含量就越低。圖2顯示了在不同pH下溶液中甲醛的含量，結(jié)果表明隨著pH升高，溶液中甲醛的含量就越高。比較圖1和圖2的結(jié)果，溶液中的甲醛含量與布羅波爾的分解量呈正相關(guān)性。因此，使用布羅波爾時(shí)需注意溶液的pH，在堿性體系下布羅波爾更容易分解且能釋放出更多的甲醛。

圖2 不同pH對(duì)布羅波爾甲醛釋放量的影響

2.2 時(shí)間對(duì)布羅波爾穩(wěn)定性和甲醛釋放的研究

在pH=7的水溶液中加入0.05%布羅波爾，攪拌均勻后，在25 ℃下靜置1 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d后，用高效液相色譜法檢測(cè)布羅波爾和甲醛的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同放置時(shí)間下布羅波爾穩(wěn)定性與甲醛釋放情況

溶液中布羅波爾含量隨時(shí)間的變化和溶液中甲醛的含量，由圖3所示。

表4發(fā)現(xiàn)，在pH=7的水溶液中，布羅波爾穩(wěn)定性隨儲(chǔ)存時(shí)間增加而下降，而甲醛含量也隨時(shí)間增加而上升。圖3比較發(fā)現(xiàn)，在儲(chǔ)存不超過(guò)3 d，布羅波爾和甲醛含量的變化比較明顯，但儲(chǔ)存超過(guò)3 d后，兩者變化趨于平緩。這可能是布羅波爾水解存在化學(xué)平衡，當(dāng)超過(guò)一定濃度后，布羅波爾其釋放甲醛的量會(huì)趨于飽和；放置28 d后，布羅波爾釋放的甲醛含量也僅為13.5 mg/kg，如此低的甲醛含量，并不足以抑制微生物的繁殖，因此，布羅波爾并非通過(guò)釋放甲醛起殺滅微生物作用。

圖3 不同放置時(shí)間下布羅波爾的穩(wěn)定性和釋放甲醛情況

2.3 溫度對(duì)布羅波爾穩(wěn)定性和甲醛釋放的研究

在pH=7的水溶液中加入0.05%布羅波爾，攪拌均勻后，在25 ℃、45 ℃、65 ℃和85 ℃下靜置24 h后，用高效液相色譜法檢測(cè)布羅波爾和甲醛的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同溫度下布羅波爾穩(wěn)定性與甲醛釋放情況

溶液中布羅波爾含量隨溫度的變化和溶液中甲醛的含量，由圖4所示。

通過(guò)圖4比較發(fā)現(xiàn)，在pH=7的水溶液中，布羅波爾穩(wěn)定性隨儲(chǔ)存的溫度升高而下降，而甲醛含量也隨溫度升高而上升。上述結(jié)果表明了布羅波爾的穩(wěn)定性和釋放甲醛含量與溫度有一定的關(guān)系。

圖4 不同放置溫度下布羅波爾的穩(wěn)定性

2.4 乙酰丙酮比色法和高效液相色譜法檢測(cè)甲醛的比較

在不同品種的化妝品中，分別加入0.01%、0.05%和0.1%的布羅波爾，攪拌均勻后，在25 ℃下靜置24 h。分別采用高效液相色譜法和乙酰丙酮比色法，檢測(cè)化妝品中的甲醛含量，結(jié)果見(jiàn)表6所示。

表6 乙酰丙酮比色法和高效液相色譜法檢測(cè)化妝品中甲醛含量

從表6結(jié)果可以看出，采用乙酰丙酮法測(cè)甲醛所得的結(jié)果，均比采用高效液相色譜法測(cè)甲醛的結(jié)果要高。比較兩者方法，乙酰丙酮法衍生后通過(guò)測(cè)吸光度，可能存在布羅波爾自身，或化妝品中其他的一些物質(zhì)，與乙酰丙酮發(fā)生顯色反應(yīng)，造成了假陽(yáng)性現(xiàn)象，因而引起檢測(cè)結(jié)果偏高；而高效液相色譜法采用二硝基苯肼衍生后在352 nm下檢測(cè)，甲醛的衍生產(chǎn)物和其他物質(zhì)的衍生產(chǎn)物出峰時(shí)間不同，故可以更精確檢測(cè)得到甲醛含量。

在我國(guó)2015年版的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定，化妝品種甲醛含量超過(guò)0.05%(等同于500 mg/kg)就需要在標(biāo)簽上標(biāo)注“含甲醛”，采用兩者方法檢測(cè)所得到的的甲醛含量，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于需要標(biāo)注的要求，因此布羅波爾作為化妝品防腐劑使用時(shí)，引起甲醛超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)性也較小，需要額外標(biāo)注情況可能性較低。

3 總結(jié)

本文研究了布羅波爾在不同的添加量、使用pH、添加溫度、添加后放置時(shí)間和檢測(cè)方法等條件下，布羅波爾的穩(wěn)定性和釋放甲醛情況。研究結(jié)果表明，布羅波爾隨著pH、溫度增高，或放置時(shí)間的增加，穩(wěn)定性降低，且產(chǎn)生更高的甲醛。另外，含布羅波爾的化妝品，采用乙酰丙酮比色法因可能存在假陽(yáng)性現(xiàn)象，其結(jié)果比采用高效液相色譜法測(cè)甲醛的結(jié)果偏高。最后，本次研究發(fā)現(xiàn)，在不超過(guò)28 d的短期內(nèi)，布羅波爾可釋放甲醛的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于甲醛抑菌所需的濃度，因此布羅波爾并非通過(guò)釋放甲醛起殺滅微生物作用；此外，布羅波爾作為化妝品防腐劑使用時(shí)，且引起甲醛超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)性也較小，故化妝品標(biāo)簽上需標(biāo)注“含甲醛”可能性較低。

但是，本文研究也僅為簡(jiǎn)單，粗略地研究了短時(shí)間內(nèi)布羅波爾的穩(wěn)定性和釋放甲醛情況，并未涉及超過(guò)28 d以上的布羅波爾長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定性，以及其長(zhǎng)期釋放甲醛的情況。這些內(nèi)容，將在今后的工作中繼續(xù)加以研究和完善。