蘇日娜，木 蘭，牧 丹，于晶峰*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院, 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院, 呼和浩特 010100)

吡喹酮(Praziquantel,PZQ)是由德國拜爾公司和E-Merck公司研究成功的于20世紀70年代中期發(fā)展起來一種新型的廣譜抗寄生蟲病藥物[1]。臨床應(yīng)用表明，吡喹酮為理想的新型抗吸蟲和絳蟲藥物，對吸蟲病和絳蟲病的治療效果良好，已成為治療吸蟲病和絳蟲病的首選藥物[2-4]。目前血吸蟲病的治療仍然依賴于吡喹酮單一療法。盡管吡喹酮可有效殺滅血吸蟲成蟲，但對感染相關(guān)的病理損害無效，由于吡喹酮耐藥蟲株的出現(xiàn)，尋求可替代的抗血吸蟲病藥物成為研究焦點。近年來臨床前研究和試驗發(fā)現(xiàn)，吡喹酮與多種抗瘧[5]、抗炎藥[6]、抗纖維化[7]、抗氧化劑[8]等輔助藥物聯(lián)合應(yīng)用顯示出良好的殺蟲效果。在治療過程中，如果聯(lián)合阿維菌素類抗線蟲藥物，可使吡喹酮的抗寄生蟲譜進一步擴大，對蠕蟲病也可起到一定的治療效果。同時有研究顯示[9]，在對片形吸蟲病的治療中，三氯苯噠唑起到了較好的治療效果，而吡喹酮卻無效，如果將二者聯(lián)合使用，則對所有吸蟲病和絳蟲病均可起到一定療效。郭冬梅等[10]將吡喹酮、阿苯達唑兩種藥品聯(lián)合用于治療人腦實質(zhì)型腦囊尾坳病，在相同的治療時間內(nèi)，聯(lián)合用藥與單獨用藥治療比較取得了更好的療效，并療程明顯縮短。Homeida[11-12]等對吡喹酮與阿苯噠唑互相影響的藥代動力學進行了研究，結(jié)果表明，吡喹酮的藥代動力學參數(shù)并沒有因為同時服用阿苯噠唑而受到影響，二者的半衰期改變不明顯，聯(lián)合用藥后，不僅提高了療效、縮短了療程，且安全性高，無明顯的毒副作用。在前期研制了細粒棘球絳蟲驅(qū)蟲藥——吡喹酮與狂犬弱毒疫苗的復(fù)合制劑[13],確定了含藥家兔血漿的前處理方法[14]的基礎(chǔ)上，本實驗建立了家兔血漿樣品中吡喹酮的HPLC測定方法，測定單獨和聯(lián)合狂犬弱毒疫苗制劑給藥后家兔血漿中吡喹酮的含量，繪制兩種不同給藥后吡喹酮的血藥濃度-時間曲線，并初步研究其藥代動力學特征參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 健康成年家兔15只，常規(guī)飼養(yǎng)?？崭?2 h后耳廓靜脈采血。家兔血漿用肝素鈉抗凝管收集采集的血液，3500 r/min離心10 min后，收集血漿，-20 ℃保存。

1.1.2 試驗儀器 電子天平(BS 224 S)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；高效液相色譜儀(LC-2010A HT)，日本島津公司；離心機(3-30K)，德國Sigma公司；渦動器(GL-88B)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；真空泵(SHB-III)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；12孔氮吹儀(PGC-01D)，北京晨曦科創(chuàng)科技有限公司。

1.1.3 試劑 乙腈、甲醇(色譜純，sigma公司)，吡喹酮對照品(色譜純，sigma公司，批號10129462)，狂犬病活疫苗(Flury株，瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，批號：13021)。吡喹酮原粉，新開元動物制藥有限公司提供；7%吡喹酮注射劑，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學寄生蟲學實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Discovery C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈/水(A/B)等濃度洗脫，即0.01～30.00 min，A/B=43/57；檢測波長330 nm；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。流速1.0 mL/min；檢測波長263 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液配制 精密稱取吡喹酮標準品，用乙腈配制成濃度為12 μg/mL吡喹酮對照品溶液。

1.3 體外家兔血漿樣品中喹諾酮的HPLC方法學確證

1.3.1 血漿樣品處理方法 吸取1 mL血漿樣品于10 mL離心管，加3 mL乙酸乙酯，漩渦8 min后，8000 r/min離心10 min，吸取乙酸乙酯層于另一試管中。重復(fù)提取一次，中和兩次乙酸乙酯層，于50 ℃下氮氣揮干。殘渣中加入甲醇 0.4 mL渦流振蕩溶解，8000 r/min 離心 5 min，取上清液 20 μL 進樣。

1.3.2 方法專屬性考察 按上述血漿處理方法處理含藥生物樣品和空白生物樣品后，進樣 20 μL，用上述HPLC方法測定。

1.3.3 體外家兔血漿中喹諾酮的標準曲線 精密吸取家兔空白血漿6份1.0 mL，分別加入吡喹酮標準溶液，使其血漿中吡喹酮標準溶液濃度分別為2、4、6、8、12、16 μg/mL，渦流振蕩混勻，按血漿樣品處理方法操作，吸取 20 μL，用上述HPLC條件測定，每個濃度下設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)吡喹酮峰面積平均值繪制標準曲線。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取家兔空白血漿1.0 mL，加入吡喹酮標準溶液，按血漿樣品預(yù)處理方法操作，吸取20 μL上清液，用上述HPLC條件測定。進樣時間分別在0、2、4、8、12、24 h。記錄每次進樣后吡喹酮的峰面積，采用不同時間進樣的喹諾酮的峰面積或峰高的RSD%計算穩(wěn)定性。

1.3.5 重復(fù)性試驗 精密吸取家兔空白血漿6份各1.0 mL，加入吡喹酮標準溶液，按血漿樣品處理方法操作，吸取20 μL上清液，用上述HPLC 條件測定，記錄每次進樣后吡喹酮的峰面積，采用峰面積或峰高的RSD%計算重復(fù)性。

1.3.6 回收率試驗 配制兩種標準濃度(120、90 μg/mL)的標準品樣品。用HPLC進行檢測，求算出各濃度吡喹酮峰面積。算出各濃度吡喹酮的峰面積與相對應(yīng)濃度的吡喹酮標準品峰面積的比值，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，此比值為待考察樣品的絕對回收率。

1.4 單獨給藥及聯(lián)合給藥后家兔血漿中吡喹酮的含量測定 健康成年家兔15只，常規(guī)飼養(yǎng)。實驗組分為對照組(生理鹽水)、7%吡喹酮注射劑組以及狂犬疫苗-吡喹酮復(fù)合制劑組，每組5只。實驗組根據(jù)犬與家兔的體表面積-劑量換算公式，換算成等價藥物劑量，注射用水稀釋，稀釋后體積為0.5 mL，空腹12 h后肌注。在給藥后不同時間點耳廓靜脈采血。用肝素鈉抗凝管收集采集的血液，3500 r/min離心10 min后，收集血漿，-20 ℃保存。同上采用血漿樣品處理方法，取上清液用HPLC方法測定各實驗組中吡喹酮的含量，進行統(tǒng)計學處理，繪制單獨和聯(lián)合給藥后家兔血漿中吡喹酮的血藥-濃度曲線。

像其他寄生蟲一樣，弓形蟲可以在動物和人之間傳染，其主要傳播途徑是消化道。人食用被感染的肉類或接觸被感染貓的糞便，直接或間接通過胃腸道感染弓形蟲。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性 結(jié)果如圖1、圖2所示。由圖1、圖2可以看出，空白血漿中未檢測到吡喹酮，而單一給藥后血漿中能夠明顯的檢測到吡喹酮的存在。在該方法中，吡喹酮峰保留時間在15.10 min左右、無雜峰干擾，且拖尾因子和塔板數(shù)均符合要求。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 單獨給藥血漿樣品色譜圖

2.2 標準曲線 在上述色譜條件下，吡喹酮標準品在2～16 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，直線回歸方程為y=127874x-4658.6(R2=0.9996，n=6)。標準曲線見圖3。

圖3 吡喹酮標準品標準曲線

2.3 穩(wěn)定性結(jié)果 穩(wěn)定性結(jié)果見表1。由表1可知，該方法在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定性很好，可以用于吡喹酮的定性及定量檢測。

表1 家兔血漿中吡喹酮的穩(wěn)定性結(jié)果

2.4 重復(fù)性結(jié)果 重復(fù)性結(jié)果見表2。由表2可知，該方法的重復(fù)性良好，可以用于吡喹酮的定性及定量檢測。

表2 家兔血漿中吡喹酮的重復(fù)性結(jié)果

2.5 回收率結(jié)果 回收率結(jié)果見表3。通過峰面積測定及標準曲線的計算，平均回收率為86.79%。

表3 家兔血漿中吡喹酮的回收率結(jié)果

2.6 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮含量變化 從表4可以看出，單獨給藥后，血漿中吡喹酮的含量在15 min后迅速增加，在1 h達到峰值，在4 h時含量達到低值，此后代謝緩慢，在24 h后仍能檢測到微量吡喹酮，此時的吡喹酮幾乎完全代謝。

表4 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的含量

由圖4可以看出，單獨給藥與聯(lián)合給藥后血漿中吡喹酮含量的變化趨勢幾乎完全相同，聯(lián)合給藥后血漿中的吡喹酮含量峰值較單獨給藥的要高，可見聯(lián)合給藥比單獨給藥可能更有助于吡喹酮的吸收代謝。

圖4 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的血藥濃度曲線

通過DAS3.1.1藥代動力學軟件統(tǒng)計計算后，單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的非房室模型的參數(shù)如表5所示,單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的藥峰濃度(Cmax)分別為1.163±0.013 μg/L和1.485±1.232 μg/L，聯(lián)合給藥的略高于單獨給藥。單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的藥時曲線下面積(AUC0-t)的分別為2.043±0.025 μg/L·h和2.068±0.279 μg/L·h，聯(lián)合給藥的略高于單獨給藥。單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的平均駐留時間(MRT(0-t))分別為3.976±0.423 h和3.735±0.398 h，單獨給藥的略高于聯(lián)合給藥。單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的清除率(CL)基本相同。以上結(jié)果表明，單獨給藥與聯(lián)合給藥后血漿中吡喹酮的藥代動力學參數(shù)基本相同，但是Cmax和AUC聯(lián)合給藥比單獨給藥略微高一點，而MRT稍低一些，可能說明聯(lián)合給藥比單獨給藥更有助于吡喹酮的吸收代謝。

表5 單獨給藥與聯(lián)合給藥的血漿中吡喹酮的藥代動力學參數(shù)

3 討論與結(jié)論

在本研究中，通過單獨給藥和聯(lián)合給藥后測定血藥濃度，發(fā)現(xiàn)血漿中吡喹酮含量的變化趨勢呈現(xiàn)相似的情形，在15 min后迅速增加，在1 h達到峰值，在4 h含量達到低值，此后代謝緩慢，在24 h仍能檢測到微量吡喹酮，此時的吡喹酮從體內(nèi)幾乎代謝完全。聯(lián)合給藥后血漿中的吡喹酮含量峰值較單獨給藥的藥物含量高少許，可見聯(lián)合給藥比單獨給藥可能更有助于吡喹酮的吸收代謝。藥代動力學參數(shù)計算結(jié)果與此結(jié)果相符。

實驗中發(fā)現(xiàn)，吡喹酮含量峰值的時間與武杰較為一致，與操繼躍[15]和賈冬舒[2]研究結(jié)果有些差異，本實驗的血漿吡喹酮峰值時間有所提前，這可能與實驗動物的種類、給藥方式及給藥濃度有關(guān)。何坎[16]研究了左旋和右旋吡喹酮在人體和大鼠肝微粒體的代謝，得出吡喹酮對應(yīng)異構(gòu)體在人和大鼠肝微粒體代謝有著嚴格的立體選擇，為完善本實驗提供了新的方向。對于吡喹酮不同的異構(gòu)體與狂犬疫苗的聯(lián)合代謝方面，是否也存在著立體選擇有待進一步研究。

在聯(lián)合給藥方面，未見吡喹酮和狂犬疫苗聯(lián)合給藥的文獻報道，本文就單獨給藥和聯(lián)合狂犬疫弱毒苗制劑后家兔血漿中吡喹酮的藥代動力學過程對體內(nèi)藥物吸收和代謝過程進行初步研究，以期為臨床安全合理給藥提供參考，同時為實際應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。