劉元杰，張 媛，王秀麗，張一幟，李 建，李俊平

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

目前我國動物疫苗佐劑仍然以鋁鹽佐劑為主，除此之外，也有油乳和蜂膠等佐劑疫苗批準生產(chǎn)并投入使用。佐劑是一種非特異性的免疫增強劑，可輔助特異性抗原進入機體內(nèi)，增強機體對目的抗原的免疫應答。一般認為，佐劑對疫苗作用的促進主要體現(xiàn)在兩個方面：一是增加疫苗的穩(wěn)定性，從而延長疫苗作用時間；二是激活機體免疫系統(tǒng)，增加疫苗作用強度。

目前針對新型疫苗佐劑的研究很多，主要有鋁鹽佐劑、油乳佐劑、天然佐劑、脂質(zhì)體佐劑、納米粒子佐劑、細胞因子佐劑等，部分新型佐劑已經(jīng)普遍應用，還有部分正在研究和不斷完善中。

1 鋁鹽佐劑

鋁鹽佐劑早在1926年就已經(jīng)被批準使用，在此后也一直被廣泛應用，直到現(xiàn)在仍然是動物疫苗中最主要的佐劑。鋁鹽佐劑可以誘導體液免疫反應，而且不會導致嚴重的副反應，具有較好的安全性[1]。鋁鹽佐劑價格低廉、工藝成熟，但也存在一定的缺點，如注射部位的紅腫、過敏反應，不能誘導細胞免疫應答等。近年來，分子生物學和基因工程學發(fā)展迅猛，多種DNA疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗相繼上市，傳統(tǒng)鋁鹽佐劑分子質(zhì)量小、免疫原性差等問題開始突顯，已不能滿足新型疫苗的更高要求。

2 油乳佐劑

油乳佐劑按油料區(qū)別可分為礦物油佐劑和非礦物油佐劑，按分散狀態(tài)不同分為水包油、油包水和雙相型乳液三種形式。目前應用和研究較多的油乳佐劑有白油佐劑、MF59、AS03等。

2.1 白油佐劑 目前市場上的動物油佐劑疫苗大多為白油佐劑。白油佐劑為礦物油佐劑，可以使抗原免疫時間延長，減少免疫次數(shù)。但其存在因黏度大導致的注射困難和注射部位炎癥反應的問題。研究表明，影響白油佐劑免疫效果的主要因素為芳烴、重金屬含量和白油運動的黏度兩方面[2]。白油粒子的均一性對疫苗免疫效果影響不大，但是均一性更高的白油佐劑引起的炎癥反應更輕[3]。

2.2 MF59 MF59是最具代表性的水包油佐劑，主要成分是角鯊烯，在肝臟中自然合成，易于降解。MF59中兩種非離子表面活性劑吐溫80和span85(山梨酸酐三油酸酯)可以起到穩(wěn)定油滴的作用，從而增加疫苗作用時間。MF59誘導機體產(chǎn)生的體液免疫效果明顯高于鋁鹽佐劑，同時誘導產(chǎn)生一定的細胞免疫反應。有研究顯示MF59可以產(chǎn)生Th1型和Th2型細胞免疫反應，但是未發(fā)現(xiàn)CD8+毒性T細胞免疫反應的報道[4]。MF59已經(jīng)應用于部分亞單位疫苗中，其安全性高，擴散快，而且不形成抗原儲庫[5]，但需要抗原與佐劑免疫相同位置才能增強免疫反應。有學者將自主構建的H7N9禽流感病毒疫苗加MF59制備成品疫苗，驗證了以MF59為佐劑的禽流感疫苗不僅具備長期免疫原性[6]，而且有良好的穩(wěn)定性，在2～8 ℃至少可保存30個月[7]。

2.3 AS03 AS03是葛蘭素史克公司在2009年研發(fā)的一種佐劑系統(tǒng)，與MF59相比，增加了一種主要成分α-生育酚。該物質(zhì)可以增加誘導產(chǎn)生的細胞因子水平，促進單核細胞的抗原攝取水平，進一步提高誘導產(chǎn)生的抗體水平[8]。目前AS03已經(jīng)被用于H5N1流感病毒疫苗[9]和 H7N9 流感病毒疫苗[10]臨床試驗階段的研究。

新型油乳佐劑的研究還有很多，如同樣由葛蘭素史克公司研發(fā)的AS02已經(jīng)被應用于結核病的臨床試驗階段[11]。姜佳琪等[12]對SP01佐劑進行了安全性評價，驗證了其無毒，且對實驗動物無過敏性反應。

油乳佐劑通過油乳本身對抗原的包裹使抗原可以在機體內(nèi)持續(xù)存在，從而使抗原刺激的時間延長，免疫效果大幅提高[13]。但也正是因為油乳佐劑這個特點，在持續(xù)的刺激下，機體中容易出現(xiàn)組織損傷、應激反應、礦物油的殘留等，存在一定的安全隱患。未來針對油乳佐劑的研究方向在于如何在保證其長效抗原刺激的同時進一步提高其安全性，避免因長期存在于體內(nèi)造成各種不良反應。

3 天然佐劑

天然佐劑主要來源于天然植物中提取的某些具有免疫活性的成份，這些成分具有毒性低、易于代謝的特點，主要包括蜂膠佐劑和殼聚糖佐劑等。

3.1 蜂膠佐劑 蜂膠是由從植物中提取的樹脂和蜜蜂分泌物經(jīng)特定工序加工而成的膠狀物質(zhì)，可以增強機體的體液免疫反應，增強巨噬細胞的吞噬能力，增加白細胞數(shù)量，刺激細胞因子產(chǎn)生，從而使免疫效果得到顯著提高。因其為天然物質(zhì)，與其他類型佐劑相比安全性較高。翟曉虎等[14]在豬細小病毒疫苗的研制過程中比較了油佐劑與蜂膠佐劑，發(fā)現(xiàn)蜂膠佐劑可以提高豚鼠細胞免疫和早期體液免疫。趙晶[15]比較了不同類型的蜂膠佐劑和其他佐劑豬圓環(huán)病毒疫苗活性的促進作用，結果顯示蜂膠佐劑豬圓環(huán)病毒疫苗能顯著增強豬群的特異性免疫和非特異性免疫，且具有良好的安全性，為蜂膠佐劑疫苗臨床推廣應用提供了數(shù)據(jù)支撐。

近年來蜂膠佐劑的應用已經(jīng)十分廣泛，在特定種類疫苗中，蜂膠佐劑疫苗的生產(chǎn)數(shù)量已經(jīng)遠遠超過傳統(tǒng)疫苗，有逐漸取代傳統(tǒng)疫苗的趨勢。統(tǒng)計2017-2019年部分細菌滅活疫苗批簽發(fā)數(shù)據(jù)，其中禽大腸桿菌類滅活苗、禽多殺性巴氏桿菌類滅活苗、豬鏈球菌類滅活苗三種主要細菌相關產(chǎn)品中蜂膠佐劑疫苗生產(chǎn)量占比分別為51.8%、30.4%、30.9%，從數(shù)量上看蜂膠苗在滅活苗中已經(jīng)占據(jù)了相當大的比例。

3.2 殼聚糖佐劑 殼聚糖是天然中存在的堿性多糖，化學性質(zhì)穩(wěn)定，可溶于部分無機酸中，但不溶于水。殼聚糖中游離的氨基和羥基可通過氫鍵和靜電吸引作用吸附于機體粘膜上[16]。通過作用于Toll樣受體4誘導巨噬細胞和樹突細胞的活化[17]，提高共刺激膜蛋白CD80和CD86的表達，從而激活免疫系統(tǒng)。殼聚糖能在較溫和條件下進行一系列化學修飾，形成具有不同生物特性的衍生物[18]。殼聚糖-三磷酸鹽是近年來研發(fā)出的多聚糖衍生物，克服了殼聚糖在生理pH下溶解度低的缺點，延長抗原釋放時間并降低降解率，從而提高疫苗的有效性[19]。殼聚糖是存在于昆蟲甲殼中的天然物質(zhì)，在生產(chǎn)過程中成本相對較低，而且具有良好的生物相容性，安全性較高[20]。在殼聚糖類佐劑應用的過程中，使用黏膜免疫的方法更有利于發(fā)揮其本身黏膜吸附性的優(yōu)勢。通過黏膜免疫的方法，在黏膜中可以產(chǎn)生分泌型IgA抗體，這說明殼聚糖可以促進機體的黏膜免疫[21]。

盡管殼聚糖有著安全性和黏膜吸附性的優(yōu)勢，但在實際應用的過程中還存在兩個主要問題。其一是溶解性低。殼聚糖本身不易溶于水，不利于在機體中發(fā)揮作用。一般可以通過化學修飾來提高其溶解性，但是在化學修飾過程中很難避免出現(xiàn)因重金屬殘留而導致的毒性增加。未來殼聚糖改造工藝仍然有待進一步研究。其二是黏膜免疫在機體中存在的各種阻礙，如口服易在胃中被消化，滴鼻在鼻腔內(nèi)作用時間短等問題?？梢酝ㄟ^將殼聚糖轉(zhuǎn)化為納米粒的形式來保證疫苗在體內(nèi)的持續(xù)性。有學者將新城疫病毒F基因 DNA 疫苗封裝到殼聚糖納米粒中，促進了黏膜免疫傳遞系統(tǒng)的持續(xù)釋放，提高了免疫效率[22]。

4 脂質(zhì)體佐劑

4.1 類病毒顆粒 類病毒顆粒是模擬病毒表面蛋白結構的非感染性空衣殼，可以誘導體液免疫反應和CTL等細胞免疫反應，還可以傳遞多肽、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)[23]。不同于其他病毒樣顆粒，類病毒顆粒不是在宿主內(nèi)合成，而是在體外裝配形成，所以不具有感染性。與鋁鹽佐劑相比，類病毒顆粒具有更高的安全性，因其本身為膜蛋白，更容易降解。目前類病毒顆粒已經(jīng)被廣泛應用于亞單位疫苗的載體和佐劑，如以此為基礎的流感疫苗和乙肝疫苗已經(jīng)上市[24]。

4.2 AS01 AS01是由單磷酸脂質(zhì)體(MPL)和皂素QS-21作為免疫激活劑輔以脂質(zhì)體組成。與一般油乳佐劑不同，QS-21的作用機制并非延長抗原在機體內(nèi)的存在時間，因為QS-21和抗原注射機體后24 h就不能檢測出QS-21的存在[25]。AS01的作用機制在于MPL和QS-21聯(lián)合作用于抗原，將特異性免疫反應的效力達到最大，刺激細胞毒性CD8+T細胞的產(chǎn)生[26]。2015年，應用AS01佐劑技術研發(fā)的瘧疾疫苗已經(jīng)被歐洲藥監(jiān)局批準使用。在結核病的臨床試驗中，AS01 佐劑也作為重要的技術手段被加以應用[27]。

4.3 AS04 AS04是由鋁鹽佐劑添加MPL制備而成，相比鋁鹽佐劑可以更高水平地誘導體液免疫反應和Th1型細胞反應。AS04已經(jīng)被批準應用于人宮頸癌的預防[28]和乙型肝炎疫苗[29]。

脂質(zhì)體佐劑在安全性和免疫原性上具有顯著優(yōu)點，但是制作工藝復雜，成本較高。目前脂質(zhì)體佐劑主要應用于人用疫苗，未來在大量生產(chǎn)中還有很大的技術難題需要攻破。不過其作為一種高效、安全的新型佐劑，未來在動物疫苗領域也有很大的應用前景。

5 納米佐劑

納米佐劑是指用聚合物類等納米粒子材料制成的佐劑，具有獨特物理性質(zhì)，既可避免滲入血管，又可限制納米粒子在淋巴管中的傳輸速度。納米粒子佐劑的優(yōu)勢在于可通過多種途徑與免疫系統(tǒng)的細胞相互作用，促進APCs的交叉遞呈，提高抗原對異型病毒的交叉保護力。而且其化學性質(zhì)穩(wěn)定，可以在不改變藥物作用機理的條件下發(fā)揮作用。生物相容性材料的應用促進了其在生物體內(nèi)的吸收和降解，使納米粒子佐劑有著高于傳統(tǒng)佐劑的安全性。

PLGA(poly lactic-co-glycolic acid，聚乳酸-羥基乙酸共聚物)是一種聚合物類納米粒，在機體中可自行降解。在美國，PLGA通過食品和藥品管理局(FAD)認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。用 PLGA 包被的禽流感病毒經(jīng)多種途徑免疫都明顯增強了抗體介導的免疫反應[30]。簡敏捷[31]以聚乙二醇-400(PEG-400)作為材料包裹產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌(ETEC)蛋白，開辟了治療ETEC的新方法。α-甘露聚糖肽是一種聚糖類有機納米物質(zhì)，作為佐劑能夠在轉(zhuǎn)基因小鼠模型上提高E75乳腺癌疫苗的免疫效應,具有增強基于細胞免疫的多肽類腫瘤疫苗免疫原性的能力[32]。

目前針對于納米粒子佐劑的研究以人類腫瘤病為主。在技術上，因人與動物本身免疫系統(tǒng)的差異導致在選取納米材料上存在一定的技術難題，因為不同納米材料理化性質(zhì)差異較大，由此免疫策略也不相同。

6 細胞因子佐劑

細胞因子是機體產(chǎn)生的具有廣泛生物調(diào)節(jié)性質(zhì)的調(diào)節(jié)因子，具有免疫佐劑效應的細胞因子有干擾素和白細胞介素等。例如IL-2、IL-12和IFN-γ可促進Th1細胞的刺激，從而產(chǎn)生對細胞內(nèi)病原體細胞介導的免疫應答，IL-4、IL-5和IL-10可促進Th2 細胞的發(fā)育和抗體產(chǎn)生，在宿主抵御細胞外病原體中發(fā)揮著重要作用。柏玲等[33]在研制水貂阿留申病毒(ADV)VP2核酸疫苗時，構建了IL-12、IFN-γ細胞因子真核表達質(zhì)粒，并且在體外細胞水平鑒定了上述目的基因的成功表達。匡露寒等[34]在禽腺病毒亞單位疫苗的研發(fā)過程中添加雞源白細胞介素和γ-干擾素作為免疫佐劑，增強了疫苗的免疫保護效果。

細胞因子佐劑在使用的過程中不僅可以促進特異性免疫反應，也可以最大激發(fā)非特異性免疫，應用前景十分廣泛。但是就臨床應用而言，目前細胞因子佐劑還存在半衰期短、價格昂貴的問題[35]。除此之外，對劑量的把握也是細胞因子佐劑在應用過程中亟待解決的難題，因為劑量使用不當可能會導致潛在的自身免疫安全隱患。

7 Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)

TLRs是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR作為非催化性跨膜蛋白，可以識別微生物中具有保守結構的分子。當微生物突破機體的物理屏障，如皮膚、黏膜等時，TLR可以識別它們并激活機體產(chǎn)生免疫應答。

目前已經(jīng)鑒定的TLRs共有15種，不同動物所含TLRs種類略有不同，如在哺乳動物中有13種[36]，而禽類中有10種。不同種類的TLRs功能不同，如TLR1-6和TLR10等主要在細胞表面表達，可以識別脂蛋白、肽聚糖、鞭毛等病原體細胞膜成分；TLR3、TLR7-9等又被稱為抗病毒 TLRs，可以作為胞內(nèi)受體識別細胞內(nèi)外源雙鏈RNA[37]；TLR4和TLR5可以識別細菌脂多糖和鞭毛蛋白[38]。Bashir K等[39]在IBDV疫苗中使用了TLR2 配體和TLR3 配體為佐劑，促進了T細胞和巨噬細胞的功能，維持疫苗的免疫活性，減少了IBDV疫苗的副作用。Bhardwaj R等[40]使用TLR4 配體 LPS作為雞新城疫疫苗佐劑，血液和組織樣品中IL-12、IFN-γ、IL-4和TLR4的含量和血清效價均得到一定程度的上調(diào)，驗證了LPS引發(fā)的抗原特異性體液和細胞免疫應答的結論。

8 結 語

目前市場中獸用疫苗絕大多數(shù)仍然為鋁鹽佐劑疫苗，油乳佐劑疫苗和蜂膠苗也在市場中占重要地位。一些新型佐劑的研發(fā)是在已經(jīng)成熟應用佐劑的基礎上添加新成分，如AS04在鋁鹽基礎上添加了MPL，鄒勇娟等[41]將白油佐劑與殼聚糖微球混合作為禽流感疫苗佐劑。未來佐劑的研發(fā)方向傾向于多種佐劑組合使用，充分發(fā)揮每種佐劑的優(yōu)勢。蜂膠佐劑在滅活疫苗中占有一定的比重，但仍然有進一步發(fā)展的空間。以豬鏈球菌類滅活疫苗產(chǎn)品為例，雖然從數(shù)量上來看，蜂膠苗在滅活苗中占比達到30.9%，但蜂膠苗種類在滅活苗種類中占比只有16.7%。蜂膠苗產(chǎn)量大，但種類并不多，這也恰恰說明了已有蜂膠苗已經(jīng)被市場所認可。不過，蜂膠佐劑雖然在部分特定種類疫苗中市場數(shù)據(jù)可觀，但其免疫效果仍需要進一步跟蹤觀察，針對蜂膠佐劑的作用機理也需要進一步研究。未來可以應用蜂膠佐劑技術對已有傳統(tǒng)疫苗進行升級改造，擴大蜂膠佐劑的應用范圍。納米佐劑、脂質(zhì)體佐劑、細胞因子佐劑等技術手段相對復雜，還有很大的技術難題需要攻破，如納米佐劑的材料選取難題和細胞因子佐劑的劑量控制難題。除此之外，成本問題也是疫苗在臨床應用過程中必須面對的問題。當前已經(jīng)被批準使用的如MF59、AS系列佐劑和重構流感病毒顆粒等主要應用于人用疫苗，這些技術在未來動物疫苗領域的應用具有很大空間，隨著技術的不斷完善，相信會有越來越多的新型動物疫苗出現(xiàn)。