苗 艷，朱慶賀，陳 亮，蘭世捷，馮萬宇，李 丹，黃寶銀，沈思思，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

雛鵝痛風(fēng)是一種由新型鵝星狀病毒(Goose astrovirus, GoAstV)引起的以內(nèi)臟尿酸鹽沉積為主要特征的疾病[1]，4～21日齡雛鵝易感，發(fā)病率80%左右，致死率30%～50%[2-4]。該病首次于2017年爆發(fā)，近年來在黑龍江、遼寧、江西、湖南、福建、河北、江蘇、安徽、山東、河南、廣東、四川等省都有爆發(fā)該病的報(bào)道，目前尚無有效疫苗可用，給養(yǎng)鵝業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。鵝細(xì)小病毒病是一種由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的急性、接觸性、致死性疾病，以發(fā)生滲出性腸炎為主要特征，主要侵害4～20日齡雛鵝。該病傳播速度快，發(fā)病率和致死率都較高，對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)威脅巨大，嚴(yán)重限制了養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，目前中國、英國、瑞典等多個(gè)國家和地區(qū)都對(duì)該病進(jìn)行了報(bào)道[8-10]。

GoAstV和GPV是對(duì)水禽養(yǎng)殖威脅嚴(yán)重的兩種病毒，目前已有二者混合感染的報(bào)道[11-12]，因此急需一種能夠快速、特異鑒別診斷這兩種病毒的方法用于流行病學(xué)調(diào)查和疾病防控。目前用于檢測(cè)GPV的方法有ELISA、TaqMan PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫PCR等[13-15]；用于檢測(cè)GoAstV的方法主要是TaqMan PCR[16]。PCR檢測(cè)方法較ELISA、TaqMan PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫PCR等檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、易操作、檢測(cè)時(shí)間短、成本低等特點(diǎn)，而且也具有較高的特異性和敏感性；而雙重PCR可在同一體系中同時(shí)對(duì)兩種病原進(jìn)行檢測(cè)。因此，本研究根據(jù)GoAstV和GPV基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成了兩對(duì)特異性擴(kuò)增引物，對(duì)PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究建立了一種可同時(shí)檢測(cè)GoAstV和GPV的雙重PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 鵝星狀病毒病、鵝細(xì)小病毒病陽性病料均由實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購自元亨生物技術(shù)有限公司；Taq酶、M-MLV、RNase Inhibitor購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；PMD19-T購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 多功能基因擴(kuò)增儀，F(xiàn)lexCycler2型，德國耶拿分析儀器股份公司；電子分析天平，ME204/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；電泳儀(DYY-6D型)、紫外儀(WD-9403D型)，北京六一生物科技有限公司；雙光速紫外可見分光光度計(jì)，UV-1900 PC型，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的GoAstV和GPV的基因序列，通過DNAStar軟件比對(duì)篩選出各自序列的相對(duì)保守區(qū)域，利用Oligo7.0、primer5.0設(shè)計(jì)引物。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)結(jié)果

1.2.2 樣品的處理和模板的制備 取GoAstV和GPV的組織病料樣品放入研缽中充分研磨，向研缽中加入適量0.9%的生理鹽水稀釋病料，取稀釋好的病料以8000 r/min離心5 min，取上清150 μL于干凈的EP管中備用。GoAstV和GPV總RNA和總DNA的提取分別按照RNA提取試劑盒和DNA提取試劑盒說明書上所述方法進(jìn)行，再將所提取的GoAstV總RNA按照反轉(zhuǎn)錄酶說明書上所述方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽性重組質(zhì)粒的制備 取所制備的模板DNA進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系如下(25 μL)：無菌水16.3 μL，10 × pfu buffer 2.5 μL；Taq DNA Polymerase 0.2 μL；dNTP(2.5 mmol/L)2 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL；模板DNA 2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，47.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收、純化。將所回收的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化至Dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果顯示正確的陽性重組質(zhì)粒保存于-20 ℃中備用。

1.2.4 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化(引物濃度和退火溫度)以所制備的GoAstV和GPV兩種病毒的陽性重組質(zhì)粒為模板，按照1.2.3中的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)其中的退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，即退火溫度在47～52 ℃之間選取了7個(gè)梯度進(jìn)行優(yōu)化，兩種病毒的引物濃度組合情況見表2，其他條件不變。

表2 引物濃度優(yōu)化組合

1.2.5 特異性檢測(cè) 以GoAstV和GPV陽性重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)陽性，用上述所建立的雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)GPMV、GAIV、GADV和GoCV 的DNA或cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)所建立雙重PCR方法的特異性。

1.2.6 敏感性檢測(cè) 分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定GoAstV和GPV陽性重組質(zhì)粒的濃度，計(jì)算模板質(zhì)粒的拷貝數(shù)，將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，共9個(gè)梯度，即1.25×108copies～1.25×100copies。

1.2.7 臨床樣品的檢測(cè) 共采集50份臨床鵝組織樣品，按照1.2.2中的方法處理樣品，并提取和制備模板，用上述實(shí)驗(yàn)中所建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中人工混合的兩種病毒的陽性樣品作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增和陽性重組質(zhì)粒的鑒定 以所制備的GoAstV病毒的cDNA和GPV病毒的DNA為模板，按照1.2.3中的方法對(duì)GoAstV和GPV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別特異性擴(kuò)增出目的片段，大小分別為461 bp和135 bp，與預(yù)期大小一致。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。兩種病毒目的片段陽性的重組質(zhì)粒測(cè)序分析結(jié)果表明，成功構(gòu)建了以上兩種病毒的pMD19-T陽性重組質(zhì)粒。

M: DL2000 Marker；1: GoAstV PCR產(chǎn)物；2: GPV PCR產(chǎn)物；3: 陰性對(duì)照

2.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 當(dāng)退火溫度為47.9 ℃，GoAstV和GPV引物濃度分別為1.0 μmol/L和1.5 μmol/L時(shí)，各目的基因片段均能得到較好的擴(kuò)增，優(yōu)化產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2和圖3。

M: DL2000 Marker；1: 47.0 ℃；2: 47.3 ℃；3:47.9 ℃；4: 48.9 ℃；5: 50.1 ℃；6: 51.1 ℃；7: 51.7 ℃；8: Negative control

M: DL2000 Marker；1-8：組合1-組合8；9: 陰性對(duì)照

2.3 PCR的特異性 所建立的雙重PCR檢測(cè)方法能夠特異性擴(kuò)增GoAstV和GPV兩種病毒的單一陽性樣品和混合陽性樣品，而對(duì)GPMV、GAIV、GADV和GoCV陽性樣品均無擴(kuò)增(圖4)，表明所建立的雙重PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性。

M: DL2000 Marker；1: GoAstV+GPV；2:GoAstV；3: GPV；4: GPMV；5: GAIV；6: GADV；7:GoCV；8: Negative control

2.4 PCR的敏感性 所建立的雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)GoAstV和GPV的最低檢測(cè)拷貝數(shù)分別為1.25×103copies和1.25×105copies，結(jié)果如圖5所示，表明所建立的雙重PCR檢測(cè)方法敏感度較高。

M: DL2000 Marker；1:1.25×108copies；2: 1.25×107copies；3: 1.25×106 copies；4: 1.25×105 copies；5: 1.25×104 copies；6: 1.25×103 copies；7: 1.25×102 copies；8: 1.25×101copies；9: 1.25×100 copies；10: Negative control

2.5 PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)所采集的50份臨床鵝組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出GoAstV 35份、GPV 2份，GoAstV和GPV混合感染2份，結(jié)果如表3所示，表明所建立的雙重PCR檢測(cè)方法能夠用于GoAstV 和GPV臨床樣品的檢測(cè)。

表3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

GoAstV是一種2017年新出現(xiàn)的病毒，自發(fā)現(xiàn)以來已被廣泛報(bào)道；GPV是一種引起水禽(鴨、鵝)高發(fā)病率和死亡率的病毒。本研究根據(jù)GoAstV和GPV在相應(yīng)文獻(xiàn)中提到的最保守基因進(jìn)行設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，所擴(kuò)增出的條帶大小相差在200 bp以上，易于區(qū)分，成功建立了一種可以同時(shí)對(duì)GoAstV和GPV進(jìn)行檢測(cè)的雙重PCR檢測(cè)方法，且特異性強(qiáng)、敏感性高，對(duì)GoAstV和GPV陽性重組質(zhì)粒的最低檢測(cè)拷貝數(shù)分別為1.25×103copies和1.25×105copies。臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，GoAstV的檢出率達(dá)70%以上，說明GoAstV的感染率較高，危害嚴(yán)重。所檢出的兩份GPV都與GoAstV呈混合感染，說明GPV和GoAstV可能常易伴發(fā)感染。由于目前樣品檢測(cè)數(shù)目的限制，還需進(jìn)一步進(jìn)行臨床樣品的收集和檢測(cè)。本研究中所建立的雙重PCR檢測(cè)方法能夠用于監(jiān)測(cè)GoAstV和GPV在中國的流行情況，并可作為診斷這兩種疾病的工具。