彭文繡

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

馬波沙星(Marbofloxacin，MBF)，又稱麻保沙星，是由瑞士羅氏公司研制開(kāi)發(fā)的一種新型動(dòng)物專用氟喹諾酮類抗菌藥，具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物交叉耐藥少等特點(diǎn)[1]。1995年，該藥首次在英國(guó)上市，主要用于貓、犬細(xì)菌性疾病的防治[2]。我國(guó)于2014年批準(zhǔn)該藥為國(guó)家二類新獸藥，用于敏感菌所致的犬呼吸道感染。已有文獻(xiàn)主要圍繞MBF在不同動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行報(bào)道[3-9]，這些研究表明，MBF內(nèi)服及腸外給藥后吸收迅速且完全，體內(nèi)分布廣泛，生物利用度高，提示了該藥在畜禽泌尿道、皮膚及深部組織感染等方面的防治具有巨大潛力。為滿足今后工作需求，促進(jìn)MBF標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，獸醫(yī)臨床用藥的規(guī)范以及檢驗(yàn)檢測(cè)方法的建立與選擇，本文從MBF的理化性質(zhì)、合成途徑、作用機(jī)制與體外抗菌活性、安全性以及含量或殘留檢測(cè)方法等方面進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)深入開(kāi)展其相關(guān)研究與應(yīng)用提供參考。

1 理化性質(zhì)

MBF化學(xué)名為9-氟-2,3-二氫-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶-[3,2,1-ij](4,1,2)苯并噁二嗪-6-羧酸，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，分子式C17H19FN4O4，分子量362.35，為黃色或淡黃色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)為268～269 ℃，微溶于水，略溶或微溶于二氯甲烷，極微溶于96%的乙醇[10]。

圖1 馬波沙星的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 合成途徑

傳統(tǒng)工藝中以2，3，4，5-四氟苯甲酸為原料，經(jīng)酰氯化、縮合、水解、環(huán)合等9步反應(yīng)得到目標(biāo)化合物，總收率為32%[11]。嚴(yán)智等[12]進(jìn)一步改進(jìn)工藝，將2，3，4，5-四氟苯甲酸酰氯化后產(chǎn)物與3-(N-甲基-甲酰肼基)-丙烯酸乙酯偶聯(lián)、環(huán)合，再與4-甲基哌嗪縮合、水解、環(huán)合，氨水中和，經(jīng)7步反應(yīng)制得最終產(chǎn)物，總收率為47.7%。單國(guó)洋等[13]以2，3，4，5-四氟苯甲酰氯為起始原料，與3-(4-甲基哌嗪-1-基)-丙烯酸乙酯反應(yīng)，再與N-甲基甲?；掳坊?，胺化物再經(jīng)環(huán)合、縮哌、堿解，最后環(huán)合得到MBF。該方法安全高效，關(guān)鍵步驟可采用一鍋法技術(shù)，廢水廢氣排放減少，總收率可提高到51%，所得產(chǎn)物質(zhì)量符合要求，純度≥99.9%，具有較高的工業(yè)化價(jià)值。

3 作用機(jī)制與體外抗菌活性

MBF是通過(guò)抑制細(xì)菌DNA回旋酶(又稱II型拓?fù)洚悩?gòu)酶)A亞基活性，阻止細(xì)菌DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。除II型拓?fù)洚悩?gòu)酶外，MBF還對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的IV型拓?fù)洚悩?gòu)酶具有抑制作用[10,14]。這一作用機(jī)制不同于其他抗菌藥物，故MBF產(chǎn)生交叉耐藥的可能性很小。

MBF抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌和球菌、某些厭氧菌也比較敏感。Josef Bolte等[15]通過(guò)研究牛乳腺炎病原體對(duì)常用抗生素的敏感性發(fā)現(xiàn)，MBF抑制50%與90%克雷伯氏菌屬生長(zhǎng)的最低藥物濃度(50% minimun inhibitory concentration, MIC50; 90% minimun inhibitory concentration, MIC90)分別為0.03 μg/mL與0.125 μg/mL，對(duì)大腸埃希氏菌的MIC50、MIC90分別為0.03 μg/mL與1.0 μg/mL，明顯低于頭孢喹肟、阿莫西林克拉維酸鉀、磺胺甲噁唑/甲氧芐氨嘧啶的MIC值。A.Bousquet-Melou等[16]對(duì)馬臨床分離的病原菌體外抑菌活性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，MBF對(duì)腸桿菌科(包括沙門氏菌、大腸埃希氏菌、肺炎桿菌)的MIC范圍為0.008～0.03 μg/mL，MIC90為0.027 μg/mL；對(duì)鏈球菌科(包括獸疫鏈球菌、馬鏈球菌)的MIC范圍為0.5～2.0 μg/mL，MIC90為1.667 μg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC范圍和MIC90分別為0.12～0.25 μg/mL、0.21 μg/mL；對(duì)銅綠假單孢菌的MIC范圍為0.12～2.0 μg/mL。Aude A.Ferran等[17]報(bào)道了MBF對(duì)犬源性金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/L，假中間葡萄球菌的MIC為0.25 mg/L。M.Grobbel等[18]首次研究了MBF對(duì)牛和豬臨床分離的病原體體外抗菌活性(表1)，測(cè)得其對(duì)牛曼氏桿菌、大腸埃希氏菌、支氣管炎博德特菌的活性明顯強(qiáng)于恩諾沙星。Peter Silley等[19]報(bào)道了MBF對(duì)貓、犬厭氧菌的體外抗菌活性(表2)，其活性相當(dāng)或略強(qiáng)于恩諾沙星、二氟沙星和依巴沙星。岳永波等[20]報(bào)道MBF對(duì)豬臨床分離病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均有較低的最小抑菌濃度，其MIC50和MIC90分別為8和64 μg/mL、4和64 μg/mL、1和16 μg/mL，對(duì)臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌活性明顯高于諾氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和強(qiáng)力霉素，對(duì)臨床分離大腸桿菌的抑菌活性高于恩諾沙星。

表1 馬波沙星對(duì)牛和豬臨床分離的病原菌的體外抗菌活性

表2 馬波沙星對(duì)貓、犬厭氧菌的體外抗菌活性

4 安全性

沈建忠等[21]選用Wistar大鼠和昆明系小鼠對(duì)MBF的遺傳毒性進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，MBF對(duì)Wistar大鼠口服半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)大于5000 mg/kg，對(duì)昆明系小鼠口服 LD50為1000 mg/kg。該藥在抑菌劑量之下對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無(wú)致突變作用；以低、中、高三組劑量(125、250和500 mg/kg)灌胃給藥，小鼠骨髓有微核多染紅細(xì)胞率未顯著升高且不會(huì)導(dǎo)致因雄性小鼠生殖細(xì)胞染色體畸變而造成的早期胚胎死亡。20 mg/kg和100 mg/kg劑量的MBF對(duì)母鼠的生殖機(jī)能和胎鼠的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯影響，對(duì)胎鼠不產(chǎn)生致畸作用，500 mg/kg劑量MBF對(duì)胎鼠體長(zhǎng)和骨骼發(fā)育有一定影響，但不存在劑量反應(yīng)關(guān)系。這些結(jié)果表明，MBF無(wú)明顯的致突變性和致畸性。

張玲玲等[22]對(duì)國(guó)產(chǎn)MBF的體外毒性進(jìn)行了研究，分別對(duì)小鼠進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)、骨髓微核試驗(yàn)和亞慢性毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)MBF經(jīng)口LD50為887.8 mg/kg，屬低毒物質(zhì)，精子畸形試驗(yàn)和骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明MBF無(wú)致突變作用。當(dāng)按照178、89和18 mg/kg的劑量連續(xù)灌胃30 d，小鼠未見(jiàn)死亡，臟器系數(shù)、血常規(guī)及生化指標(biāo)較陰性對(duì)照組雖有顯著變化，但均在正常值范圍內(nèi)，國(guó)產(chǎn)MBF按推薦劑量使用安全，無(wú)致畸和致突變作用。

魏麗娟等[23]評(píng)價(jià)了MBF注射液在靶動(dòng)物豬中的安全性。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用1～5倍推薦劑量的10% MBF注射液的受試母豬均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，血常規(guī)及生化指標(biāo)未發(fā)生顯著改變，各推薦劑量組對(duì)母豬的組織/器官均無(wú)明顯影響，在2.5～50.0 mg/kg的劑量范圍內(nèi)，MBF安全有效。

5 含量或殘留檢測(cè)方法

為了客觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)MBF在動(dòng)物體內(nèi)的消除規(guī)律，制定合理的臨床給藥方案以及保證動(dòng)物源性食品的質(zhì)量安全，已有研究者建立方法對(duì)MBF的藥物含量或殘留進(jìn)行檢測(cè)。

5.1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)法 酶聯(lián)免疫法特異性和靈敏度高，不需要昂貴的儀器設(shè)備，適用于大量樣品的快速篩選。目前，還未見(jiàn)MBF殘留快速檢測(cè)試劑盒上市。已有的研究中[24]，以MAR-HRP為異源酶標(biāo)抗原建立的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，可以同時(shí)檢測(cè)牛奶中氧氟沙星、MBF、氟羅沙星三種喹諾酮類藥物的含量。若以諾氟沙星為抗體，通過(guò)條件優(yōu)化，抗體包被量為1 μg/mL，酶標(biāo)抗原稀釋比例為1∶50000，0.5%乳粉作為封閉液，封閉和競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間各為30、60 min，建立的諾氟沙星直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)牛奶中包含MBF在內(nèi)的十六種喹諾酮類藥物的殘留。趙貴山等[25]利用制備的MBF單克隆抗體與稀釋的MBF溶液混合均勻，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)藥物殘留，檢測(cè)的MBF濃度范圍為100～5000 pg/mL。該方法制備出針對(duì)MBF的特異性強(qiáng)和親和力高的單克隆抗體，為MBF酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的推廣提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

5.2 熒光分光光度法 MBF核心部分為喹啉，具有較大的共軛結(jié)構(gòu)和剛性，可產(chǎn)生較顯著的熒光，適合采用熒光分光光度法進(jìn)行測(cè)定。該方法具有專屬性強(qiáng)、樣品用量少、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，常用于微量甚至痕量物質(zhì)的定量分析。謝軍[26]利用陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨增強(qiáng)MBF體系的熒光強(qiáng)度，在pH 5.0的鹽酸-檸檬酸鈉緩沖液中，以303 nm為最大激發(fā)波長(zhǎng)、506 nm為最大發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定血液中MBF含量。檢測(cè)線性范圍為5.5×10-8～3.0×10-6mol/L，檢測(cè)限為4.6×10-8mol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.5%。

5.3 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。它具有使用方便快速，便于基層和現(xiàn)場(chǎng)使用；成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備；不需要使用有潛在致癌性的酶顯色底物或放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)，適用于藥物殘留的快速篩查。

孫曉崢等[27]將環(huán)丙沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，免疫小鼠后篩選得到特異性單克隆抗體。以純化后的單克隆抗體標(biāo)記膠體金顆粒作為金標(biāo)墊，以環(huán)丙沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物和兔抗鼠 IgG作為檢測(cè)限和質(zhì)控限，組裝檢測(cè)氟喹諾酮類抗生素殘留的膠體金免疫層析試紙條，用于臨床氟喹諾酮類抗生素殘留的快速檢測(cè)和大量樣品的篩選。該法特異性強(qiáng)、靈敏度高、廣譜性好、臨床適用性強(qiáng)，肉眼于10 min內(nèi)即可判定結(jié)果。

5.4 超高液相色譜法 超高效液相色譜法的原理與高效液相色譜法基本相同，但其分析速度、靈敏度及分離度高于高效液相色譜，大大縮短了分析時(shí)間，減少了溶劑用量，降低了分析成本。趙莉等[28]建立了超高效液相色譜法檢測(cè)豬肉中MBF殘留。該方法以氧氟沙星為內(nèi)標(biāo)，樣品經(jīng)三氯甲烷提取后吹干、復(fù)溶，正己烷除脂，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，方法的線性范圍為10～1000 μg/kg(r=0.9994)，檢出限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg，平均回收率為85.80%～103.20%，其分析速度、靈敏度及分離度分別是高效液相色譜法的9、3、1.7倍。

5.5 高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 高效液相色譜法是檢測(cè)此類藥物殘留分析方法中最重要和最基本的方法，液質(zhì)聯(lián)用則有助于提供混合物的相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息。賈國(guó)賓等[29]建立的高效液相色譜法可測(cè)定豬肝臟、肌肉、腎臟、脂肪等組織中MBF的殘留量。惠蕓華等[30]建立的方法可以同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中包含MBF在內(nèi)的9種氟喹諾酮類藥物殘留量。宮小明等[31]優(yōu)化樣品前處理方法，采用梯度洗脫和程序波長(zhǎng)建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)8種氟喹諾酮類多殘留的高效液相色譜法。這些方法采用的儀器均比較普及，通用性強(qiáng)，可滿足基層檢測(cè)需求。錢卓真等[32]建立的水產(chǎn)品中19種喹諾酮類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可涵蓋所有用于魚(yú)類病害防治的喹諾酮類藥物。該方法用酸化乙腈提取水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物，正己烷脫脂，在電噴霧電離源，正離子掃描模式下運(yùn)用外標(biāo)法定量檢測(cè)。19種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸系數(shù)均在0.99以上，線性范圍為2～200 ng/mL，MBF的檢出限為0.5 μg/kg、定量限為1.0 μg/kg，可滿足實(shí)驗(yàn)室批量樣品分析的需求。

6 結(jié) 論

從長(zhǎng)期積累的經(jīng)驗(yàn)以及在畜禽、寵物領(lǐng)域的研究結(jié)果可以看出，MBF具有給藥方便，廣譜、低毒、高效等特點(diǎn)，已成為繼恩諾沙星之后，畜禽及寵物疾病領(lǐng)域又一動(dòng)物專用氟喹諾酮類抗菌新藥[33]，在防治動(dòng)物疾病方面發(fā)揮著極為重要的作用。

盡管研究已證實(shí)，MBF安全劑量范圍寬，極少引起諸如惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣等不良作用[34]，且無(wú)明顯生殖和遺傳毒性，長(zhǎng)期使用，對(duì)動(dòng)物血常規(guī)、生化指標(biāo)、組織/器官形態(tài)無(wú)顯著影響，但張福濤發(fā)現(xiàn)[35]，MBF在24 h內(nèi)能夠以劑量和時(shí)間依賴方式引起體外幼齡犬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率下降，凋亡升高。目前，未見(jiàn)針對(duì)這一潛在不良反應(yīng)所進(jìn)行的系統(tǒng)性研究，建議后續(xù)可開(kāi)展相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)，補(bǔ)充完善MBF的安全性資料。

文獻(xiàn)報(bào)道的MBF對(duì)不同細(xì)菌的體外抗菌活性和MIC值對(duì)該藥抗菌譜的界定、給藥劑量的選擇具有一定參考價(jià)值，有助于臨床獸醫(yī)經(jīng)驗(yàn)性治療的開(kāi)展。需要注意的是，隨著藥物長(zhǎng)期使用，細(xì)菌耐藥性也不斷發(fā)生變化，為確保治療安全有效，有條件的地區(qū)應(yīng)定期更新抗菌藥對(duì)不同細(xì)菌體外抗菌活性的研究資料，或在疾病治療前進(jìn)行藥敏性試驗(yàn)，優(yōu)先選擇有效的窄譜藥物，按照療程規(guī)范使用，避免頻繁換藥，以延緩抗菌藥物耐藥性的產(chǎn)生。

有關(guān)MBF在動(dòng)物組織殘留的問(wèn)題已引起人們的關(guān)注，尋找更為方便快捷的檢測(cè)方法尤為重要。文獻(xiàn)中，不同研究者建立的含量或殘留檢測(cè)方法具有藥物涵蓋范圍廣、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可滿足不同領(lǐng)域、不同層面、不同場(chǎng)合的工作需求，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)有公告及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)還未對(duì)MBF限量值作出明確規(guī)定，有關(guān)部門應(yīng)加快制定完善獸藥殘留檢測(cè)的程序和依據(jù)，加強(qiáng)MBF的使用監(jiān)管，促進(jìn)藥物科學(xué)合理應(yīng)用，進(jìn)一步保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)態(tài)發(fā)展。