熊海波，劉云鵬，徐慶陽(yáng),2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津， 300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津， 300457)3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津， 300457)

L-異亮氨酸作為哺乳動(dòng)物8種必需氨基酸之一，是合成人體激素及酶類的原料，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成并抑制其分解[1]。近年來(lái),隨著L-異亮氨酸在醫(yī)藥保健、食品加工和飼料工業(yè)中的應(yīng)用研究不斷深入,市場(chǎng)對(duì)L-異亮氨酸的需求在不斷生長(zhǎng)。L-異亮氨酸雖已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),但目前產(chǎn)量仍不能滿足需要，目前我國(guó)L-異亮氨酸的需求缺口較大,并且年需求量逐年增加[2]。

一般認(rèn)為微生物在生長(zhǎng)旺盛期，正常代謝不會(huì)出現(xiàn)在培養(yǎng)液中大量分泌特定的中間代謝物的現(xiàn)象，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamate)為了積累特定的氨基酸，必須使用某些方法使其代謝或結(jié)構(gòu)異?；痆3-5]。谷氨酸棒桿菌發(fā)酵在不同的階段細(xì)胞形態(tài)會(huì)產(chǎn)生不同的變化，增殖培養(yǎng)時(shí)期菌株以生長(zhǎng)分裂、倍速擴(kuò)增菌體生物量為目的，而在生產(chǎn)目的產(chǎn)物異亮氨酸時(shí)，需要實(shí)現(xiàn)菌體形態(tài)的“發(fā)酵轉(zhuǎn)換”，限制細(xì)胞膜的合成，菌體伸長(zhǎng)、膨脹，形成生產(chǎn)型細(xì)胞，開始積累L-異亮氨酸[6-7]。而這種“發(fā)酵轉(zhuǎn)換”，需要通過(guò)各種物理、化學(xué)或生物手段對(duì)細(xì)胞膜的合成或細(xì)胞膜本身進(jìn)行干擾或破壞[8]。這些方法包括發(fā)酵液中添加表面活性劑、CaCl2、限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量、減少葡萄糖供應(yīng)使菌體處于亞生長(zhǎng)狀態(tài)等[9]。

研究表明超聲對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)生的微擾動(dòng)可以加速細(xì)胞間的物質(zhì)交換，加強(qiáng)發(fā)酵液中的CO2和O2的交換速率，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而超聲產(chǎn)生的切向力可在細(xì)胞表面瞬間造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性和產(chǎn)酸能力[14]。研究通過(guò)在發(fā)酵罐內(nèi)添加超聲裝置，在發(fā)酵的某些時(shí)期對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行在線超聲，通過(guò)增強(qiáng)發(fā)酵液的流動(dòng)性及增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，解決谷氨酸棒桿菌發(fā)酵適應(yīng)期較長(zhǎng)，菌體產(chǎn)酸轉(zhuǎn)型慢、轉(zhuǎn)型不徹底的問(wèn)題[10-13]。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌YILM1504，由天津科技大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖60 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨12 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO41.6 g/L，VB10.3 mg/L，豆餅水解液15 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，玉米漿干粉30 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS型全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L 自動(dòng)控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent Technologies；KQ-C 高壓蒸汽發(fā)生器，上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；752 分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；OLYMPUS 生物顯微鏡，日本 OLYMPUS 會(huì)社。

1.4 培養(yǎng)方法

種子罐培養(yǎng)條件：接種量2支茄形瓶(250 mL)，發(fā)酵體積2 L，培養(yǎng)溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，種子培養(yǎng)12～15 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：接種量600 mL，發(fā)酵體積3 L, 培養(yǎng)溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，發(fā)酵時(shí)間36～40 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)超聲條件的確定，如表1所示，選取超聲周期、超聲功率、超聲頻率、超聲時(shí)間、超聲模式進(jìn)行5因素4水平的L16(54)正交試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。采用綜合平衡分析法確定超聲的最佳組合條件[15]。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal experimental factors

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)Ca2+濃度

Ca2+濃度檢測(cè)參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.6.2L-蘇氨酸脫氨基酶活性檢測(cè)

在發(fā)酵罐中取適量的菌液，4 ℃ 8 000 r/min離心收集菌體，用50 mmol/L Tris-HCl清洗菌體2次，并重懸菌體。然后將懸浮菌體，經(jīng)過(guò)超聲破碎(開2 s停3 s、4 ℃、400 W、10 min)，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液。蛋白濃度通過(guò)BCA Protein Assay Kit測(cè)定。酶活性重復(fù)3次測(cè)定。L-蘇氨酸脫氨基酶的酶活性通過(guò)檢測(cè)ɑ-酮丁酸的生成來(lái)確定。L-蘇氨酸脫氨基酶的酶活定義為每分鐘生成1 μmol ɑ-酮丁酸所需要的酶活為1 U[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對(duì)菌體生物量的影響

2.1.1 超聲對(duì)菌體不同生長(zhǎng)階段的影響

L-異亮氨酸發(fā)酵是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)過(guò)程，在不同的生長(zhǎng)階段菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)、代謝途徑不同，超聲所起的作用不同。實(shí)驗(yàn)將菌體發(fā)酵分為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期、衰亡期4個(gè)階段，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在不同階段超聲，探究不同階段超聲對(duì)菌體的影響。

如圖1所示，對(duì)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵不同生長(zhǎng)階段1 h連續(xù)超聲，在適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期和平穩(wěn)期生物量分別增加了15.6%、63.2%、23.6%，這可能是在適應(yīng)期及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，超聲對(duì)菌體損傷較小，超聲加劇了培養(yǎng)基的擾動(dòng)，加速了罐內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的微擾動(dòng)，提高了細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換的傳輸速率；而在平穩(wěn)期，超聲所起到的微擾動(dòng)能力，解決了副產(chǎn)物堆積、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足等問(wèn)題，增加了菌體活力[18]。但同時(shí)，超聲對(duì)衰亡期菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面效果，菌體生物量下降了35.8%，這是因?yàn)樵诰w衰亡期，超聲剪切作用力加速了菌體破碎死亡。因此可在適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平穩(wěn)期超聲發(fā)酵，提高菌體總體基數(shù)，為產(chǎn)酸總量的提高提供生物量基礎(chǔ)。

圖1 超聲對(duì)菌體不同生長(zhǎng)階段的影響Fig.1 Influence of ultrasound on different growth stages of bacteria

2.1.2 超聲功率對(duì)菌體生物量的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別用60、80、100、120 W/L不同的超聲功率，探究超聲功率對(duì)菌體生物量的影響。

如圖2所示，超聲功率<100 W/L時(shí)，對(duì)菌體的增長(zhǎng)均有效果，在功率達(dá)到80 W/L時(shí)效果最好；但功率超過(guò)120 W/L時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。超聲刺激菌體生長(zhǎng)不一定與功率成正比，有時(shí)小功率也會(huì)產(chǎn)生增殖效果，但功率過(guò)小就會(huì)失去微擾動(dòng)及菌體刺激作用；而功率大到一定的數(shù)值，雖然擾動(dòng)及剪切效果增強(qiáng)，但空化強(qiáng)度大大增加，干擾菌體正常的生長(zhǎng)分裂，使菌體細(xì)胞膜內(nèi)外環(huán)境失衡，正常的菌體形態(tài)發(fā)生形變，破碎死亡，降低菌體活力[19]。

圖2 超聲功率對(duì)菌體生物量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the biomass of bacteria

2.1.3 超聲頻率對(duì)菌體生物量的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別用10、18、26、34、42 kHz超聲頻率，探究超聲頻率對(duì)谷氨酸棒桿菌生物量的影響。

由圖3可知，不同的超聲頻率對(duì)菌體生物量的影響較大，在超聲頻率為18 kHz時(shí)，菌體生物量下降了13.6%，但當(dāng)超聲頻率為26 kHz時(shí)，菌體生物量增加了42.4%，隨后將超聲頻率增加到42 kHz時(shí)，菌體生物量劇烈下降了45.3%。菌體的增長(zhǎng)量隨超聲頻率的梯度增加呈現(xiàn)極陡的波浪狀，生物量急速升降。這種現(xiàn)象可能類似于電磁波的窗效應(yīng)，指在某一頻段內(nèi)，只有某些個(gè)離散的、頻率區(qū)間極窄的電磁波才能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，而不同于圖2所示80 W/L是該菌功率窗，該菌的生物學(xué)效應(yīng)在26 kHz還存在1個(gè)頻率窗[20]。

圖3 超聲頻率對(duì)菌體生物量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on the biomass of bacteria

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)菌體生物量的影響

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別超聲0、2、4、6、8、10 h后，檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束后菌體生物量，探究超聲時(shí)間對(duì)菌體生物量的影響。

從圖4可知，0～8 h隨著超聲時(shí)間的增加，菌體生物量逐漸增加，在超聲6 h后，菌體增加量達(dá)到最大，隨后對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，在超聲10 h后菌體量比對(duì)照組降低了21.2%。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體增殖速度快，低頻率低能量的超聲對(duì)菌體的損傷較小，同時(shí)短時(shí)間的空化作用，形成的流體微擾動(dòng)，可以增加細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換速率，有利于菌體的生長(zhǎng)；但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使得空化事件增多，對(duì)細(xì)胞膜通透性影響增大，損壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而引起細(xì)胞崩解[21]。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)菌體生物量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the biomass of bacteria

2.1.5 超聲模式對(duì)菌體生物量的影響

設(shè)計(jì)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期使用不同的處理模式，分別為先開10 s，再停10、20、30、40、50 s，循環(huán)往復(fù)，持續(xù)6 h，探究間隔時(shí)間對(duì)菌體生物量的影響。

由圖5可知，谷氨酸棒桿菌對(duì)低頻率低能量的超聲耐受能力很強(qiáng)，在不同的處理模式下菌體生物量都有明顯的增長(zhǎng)，但在處理模式開10 s停30 s模式下，效果最好，菌體生物量增加了46%。這可能是因?yàn)閷?duì)數(shù)期菌體生長(zhǎng)旺盛，超聲處理的影響較小，且超聲波可以將微生物在培養(yǎng)過(guò)程中形成的細(xì)胞束松散開來(lái)，提高了菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)繁殖，提高了微生物的生物量。

圖5 超聲模式對(duì)菌體生物量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic pattern on the biomass of bacteria

2.2 超聲對(duì)谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-異亮氨酸的影響

在單因素基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L16(54)正交試驗(yàn)，以L-異亮氨酸生成量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，因素1均值2最大，即在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期超聲細(xì)胞菌體產(chǎn)異亮氨酸最好；因素2均值2最大，即超聲功率為80 W/L產(chǎn)酸效果最好；因素3均值1最大，即超聲頻率為18 kHz產(chǎn)酸效果最好；因素4均值1最大，超聲時(shí)間2 h對(duì)產(chǎn)酸最有利；因素5均值1最大，說(shuō)明超聲模式為開10 s停10 s產(chǎn)酸效果最好。對(duì)比表2極差數(shù)值發(fā)現(xiàn)，影響L-異亮氨酸產(chǎn)量的主要因素是對(duì)菌體超聲階段的選擇，剩下依次的超聲功率、超聲頻率、超聲模式，最后是超聲時(shí)間對(duì)L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

對(duì)比生物素與L-異亮氨酸最優(yōu)超聲條件，使用綜合平衡分析法分析得出最終超聲發(fā)酵條件，如表3所示。由表2可知，超聲周期的極差達(dá)到了11.650，說(shuō)明影響產(chǎn)酸量的最大因素是超聲周期，對(duì)比產(chǎn)酸與生物量發(fā)現(xiàn)最優(yōu)超聲條件都是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)超聲功率一致在80 W/L產(chǎn)酸量與生物量都達(dá)到最高選擇；在超聲頻率最優(yōu)條件上，生物量與產(chǎn)酸量不同，但18 kHz或26 kHz對(duì)L-異亮氨酸產(chǎn)量的均值相差不大，同時(shí)考慮到頻率越低，超聲產(chǎn)生的空化泡的數(shù)量越大，空化越強(qiáng)烈，菌體受損越嚴(yán)重，因此選擇26 kHz超聲頻率；在超聲時(shí)間和超聲模式上，生物量與產(chǎn)酸量的最優(yōu)條件也相差很大，但對(duì)于產(chǎn)酸條件來(lái)說(shuō)，極差分別為1.775和2.075，都是次要因素，為保證生物量，增加具有產(chǎn)酸能力的菌體量基數(shù)，超聲條件趨向于生物量最優(yōu)條件，即超聲時(shí)間為6 h，超聲模式為開10 s停30 s。

表3 超聲對(duì)生物量與L-異亮氨酸對(duì)比結(jié)果Table 3 Comparison results of biomass and L-isoleucine by ultrasound

2.3 超聲對(duì)跨膜行為的影響

細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)期攝取外源Ca2+的能力與胞外Ca2+的跨膜傳導(dǎo)能力有關(guān)。超聲處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，探究不同超聲時(shí)間后，細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)Ca2+濃度變化。

取超聲結(jié)束后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，F(xiàn)ura-4/AM負(fù)載后，測(cè)定胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，用負(fù)載后的溶液在激光波長(zhǎng)652 nm處比較熒光強(qiáng)度，胞內(nèi)Ca2+濃度與熒光強(qiáng)度成正比，如圖6所示，隨著超聲時(shí)間的增加，胞內(nèi)Ca2+濃度不斷升高，在超聲6 h達(dá)到最高，比未超聲前胞內(nèi)Ca2+濃度增加了75%，細(xì)胞膜與外界物質(zhì)交換頻繁，有利于胞外Fluo-4/AM熒光探針的進(jìn)入；隨后超聲時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸減弱，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)改變了菌體正常生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，與胞外的物質(zhì)和能量交換速率下降，造成Fluo-4/AM熒光探針的負(fù)載量減少，致使熒光強(qiáng)度下降。總的結(jié)果來(lái)看，超聲處理增加了細(xì)胞膜的通透性，加速了細(xì)胞膜兩側(cè)的流動(dòng)性，同時(shí)跨膜Ca2+濃度對(duì)于刺激膜蛋白活性及維持細(xì)胞膜骨架的穩(wěn)定性非常重要。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響Fig.6 Influence of ultrasound time on membrane permeability

2.4 超聲對(duì)酶活的影響

超聲功率是影響L-異亮氨酸產(chǎn)量的第二大因素，探究不同超聲功率下隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)L-蘇氨酸脫氨基酶的活性變化如圖7所示。

圖7 超聲時(shí)間與功率對(duì)酶活的影響Fig.7 Effects of ultrasonic time and power on enzyme activity

由圖7可知，L-蘇氨酸脫氨基酶活性隨超聲時(shí)間先增強(qiáng)后減小，大約在超聲4 h前后達(dá)到峰值，且超聲時(shí)間4 h，超聲功率為80 W/L時(shí)，L-蘇氨酸脫氨基酶活性最強(qiáng)，達(dá)到(0.27±0.02)U/mL；隨著超聲功率的增強(qiáng)，L-蘇氨酸脫氨基酶的活性先上升，隨后在80 W/L達(dá)到頂點(diǎn)后快速下降，酶活分別降至(0.18±0.01)U/mL(100 W/L)、(0.16±0.01)U/mL(20 W/L)。同時(shí)，低功率超聲隨著超聲時(shí)間的增加下降趨勢(shì)最為平穩(wěn)，說(shuō)明低強(qiáng)度超聲在細(xì)胞表面瞬間造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，改變了細(xì)胞膜的通透性，加速了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，但因?yàn)槠鋸?qiáng)度不夠，超聲所造成的細(xì)胞表面的傷口較小，細(xì)胞可正常修復(fù)。

2.5 超聲對(duì)菌體形態(tài)的影響

發(fā)酵3 h后經(jīng)過(guò)26 kHz，80 W/L 超聲處理谷氨酸棒桿菌對(duì)數(shù)1 h 后(其余處理?xiàng)l件均相同)，比較超聲處理的谷氨酸棒桿菌和未處理的菌體形態(tài)如圖8所示。谷氨酸棒桿菌的顯著特征是前期菌體擴(kuò)培階段菌體分散，菌體小而近圓型，以分裂擴(kuò)培為主要目的，中期菌體需要轉(zhuǎn)換菌體形態(tài)，轉(zhuǎn)為產(chǎn)酸形態(tài)，菌體粗壯呈橢圓型，菌體多為“八”字形態(tài)。而未進(jìn)行超聲處理的菌體小而圓，以分裂增殖為主，菌液經(jīng)過(guò)超聲處理后，菌體數(shù)量明顯增多，且菌體大而粗壯，活力強(qiáng)，利于產(chǎn)酸。超聲加速了菌體的增殖并提前實(shí)現(xiàn)菌體“形態(tài)轉(zhuǎn)換”，產(chǎn)酸提前，菌體產(chǎn)酸能力得到加強(qiáng)。

a-未超聲；b-超聲圖8 未超聲與超聲的菌體形態(tài)Fig.8 Morphology of bacteria without ultrasound and ultrasound

2.6 超聲對(duì)菌體生物量、產(chǎn)酸能力及葡萄糖消耗的影響

由前期工作可以得出綜合生物量與L-異亮氨酸雙重考慮的超聲標(biāo)準(zhǔn)，為在谷氨酸棒桿菌適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平穩(wěn)期，用80 W/L、18 kHz罐內(nèi)分別連續(xù)超聲2、6、1 h，超聲模式設(shè)置為每超聲10 s，停30 s，循環(huán)往復(fù)。由此設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以未超聲條件發(fā)酵為對(duì)照組，最優(yōu)超聲條件發(fā)酵為優(yōu)化組，繪制生物量與L-異亮氨酸生成量過(guò)程曲線，探究罐內(nèi)超聲結(jié)果的優(yōu)越性。

由圖9-a對(duì)照組生物量曲線可以看出，超聲后發(fā)酵適應(yīng)期幾乎消失，菌體發(fā)酵適應(yīng)階段縮短至2 h以內(nèi)，菌體快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；同時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期從2 h延續(xù)到24 h，且24 h菌體生物量達(dá)到了39.4 g/L，比對(duì)照組增加了35.7%；幾乎無(wú)衰亡期，直至40 h結(jié)束菌體活力依舊很強(qiáng)，最終菌體量達(dá)到了41.0 g/L，比對(duì)照組提高了74.5%。由圖9-a優(yōu)化組L-異亮氨酸產(chǎn)量曲線可以看出，超聲優(yōu)化后產(chǎn)酸提前了2 h，并且在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期及平穩(wěn)期，L-異亮氨酸產(chǎn)量增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，由于谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-異亮氨酸為生長(zhǎng)偶聯(lián)型，高生物量有利于產(chǎn)酸速率的提升，最終L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到了39.0 g/L，比對(duì)照組產(chǎn)酸量提升了69.6%。

由圖9-b可知，超聲后葡萄糖消耗量達(dá)到了482 g/L，比未超聲多消耗了41.97%；但葡萄糖對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率及L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率上升顯著(P<0.05)，在10 h，葡萄糖對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大，超聲后葡萄糖對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率比未超聲增加了14.92%，菌體活力旺盛；同時(shí)對(duì)比葡萄糖對(duì)L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率曲線，超聲后葡萄糖轉(zhuǎn)化率在第20 h達(dá)到最大值，延長(zhǎng)了2 h，轉(zhuǎn)化率為0.397 g/g，比未超聲增加了13.75%，且超聲20 h后，葡萄糖對(duì)L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率曲線下降速率平緩，加強(qiáng)了菌體后期產(chǎn)酸能力。

a-實(shí)心代表生物量，空心代表L-異亮氨酸產(chǎn)酸量;b-實(shí)心代表葡萄糖消耗量，空心代表葡萄糖對(duì)菌體轉(zhuǎn)化率，左空右實(shí)代表葡萄糖對(duì)L-異亮氨酸轉(zhuǎn)化率圖9 超聲與未超聲對(duì)生物量與L-異亮氨酸生成量及對(duì)葡萄糖消耗量與轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effects of ultrasound and non-ultrasound on biomass and L-isoleucine production and glucose consumption and conversion

3 結(jié)論

在發(fā)酵過(guò)程中用超聲作為物理手段處理發(fā)酵液，對(duì)于谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸效果顯著，其超聲周期、超聲功率、超聲頻率、超聲時(shí)間和超聲模式都會(huì)對(duì)菌體的增殖及產(chǎn)酸能力都有很強(qiáng)的提升能力。谷氨酸棒桿菌超聲發(fā)酵的最優(yōu)條件為：用80 W/L、26 kHz超聲波，在菌體適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及平穩(wěn)期分別超聲2、6、1 h，超聲模式設(shè)置為開10 s、停30 s。超聲形成的流體微擾動(dòng)，使發(fā)酵液中分子活性提高，可以增加細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換速率，有利于菌體的生長(zhǎng)，結(jié)果顯示，直至40 h結(jié)束菌體活力依舊很強(qiáng)，最終菌體量達(dá)到了41.0 g/L，比未超聲提高了74.5%；超聲形成的機(jī)械切向力，在細(xì)胞表面瞬間造成微傷，使細(xì)胞壁局部破裂，改變了細(xì)胞膜的通透性，加速了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換，解除了胞內(nèi)產(chǎn)物濃度過(guò)高而產(chǎn)生終產(chǎn)物抑制，最終L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到了39.0 g/L，比未超聲產(chǎn)酸量提升了69.6%。