唐詠文，崔同濤，劉勇，王敏，郭濤，劉津，譚寧

1廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州510080；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

急性心肌梗死（AMI）不僅導(dǎo)致心肌損傷，還可誘發(fā)慢性心力衰竭。心臟對(duì)缺血缺氧敏感，再灌注后出現(xiàn)心肌損傷加重，甚至誘發(fā)心功能惡化［1］，即缺血再灌注損傷（IRI）。細(xì)胞發(fā)生IRI時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加，從而導(dǎo)致心功能降低［2］。當(dāng)延遲再灌注或再灌注后出現(xiàn)慢血流、持續(xù)泵衰竭或休克時(shí)，特別是再灌注后心肌酶學(xué)持續(xù)升高時(shí)，如何有效降低再灌注損傷是治療的關(guān)鍵。研究顯示，AMI后24～48 h接受延遲經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入再灌注治療的院內(nèi)病死率和重度左心室功能不全發(fā)生率較常規(guī)藥物組降低［3］。因此，認(rèn)識(shí)延遲再灌時(shí)心肌損傷機(jī)制可為探索更優(yōu)的治療方案提供基礎(chǔ)支持，而建立相應(yīng)的動(dòng)物模型是研究的前提。為了更加接近臨床早期IRI過(guò)程，2016年1月—2018年6月我們?cè)趧?dòng)物模型上實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng)缺血后的有效再灌注，并觀察心肌細(xì)胞凋亡及心功能的變化加以驗(yàn)證?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠105只，8～10周齡，體質(zhì)量200～270 g，購(gòu)自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)在屏障系統(tǒng)中完成，飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～29℃，相對(duì)濕度40%～50%。實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣東省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理［倫理號(hào)：GDREC2014016H（R1）］，操作遵守國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利實(shí)驗(yàn)指南。

1.1.2 主要試劑與儀器 三苯基四唑氯化物（TTC，上海Invitrogen），依文思藍(lán)（Evens Blue，美國(guó)Sigma），TUNEL試劑盒（瑞士Roche），Bax抗體、Bcl-2抗體、激活態(tài)Caspase-3（Cleaved Caspase-3）抗體（美國(guó)CST），GAPDA抗體（美國(guó)Protein Tech.）。小動(dòng)物呼吸機(jī)R407（深圳瑞沃德），動(dòng)物心電圖機(jī)（成都泰盟BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)），倒置顯微鏡（德國(guó)萊卡），M型動(dòng)物心臟超聲儀（日本Visual Sonics Vevo 2100）。

1.2 大鼠心肌缺血模型的制備 大鼠禁食過(guò)夜，10%水合氯醛腹腔注射麻醉。18 G留置針行經(jīng)口腔氣管插管，外套管連接呼吸機(jī)（正壓通氣，潮氣量2.5～3.0 mL/100 g，頻率70～80次/分），四肢連接心電圖機(jī)導(dǎo)聯(lián)。大鼠仰臥固定，開(kāi)胸暴露心臟及左前降支（LAD）。以6-0縫線在直視下于肺動(dòng)脈圓錐根部進(jìn)針，左心耳下2.0～3.0 mm處出針過(guò)線，針寬2.0～3.0 mm，針深0.5～1.0 mm。輕提縫線見(jiàn)前壁心肌顏色變淡，為結(jié)扎有效。在結(jié)扎處心臟表面放置5.0 mm的橡皮筋，在其上打結(jié)。以前壁心肌呈蒼白色、心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段弓背抬高大于0.1 mV為缺血成功。

1.3 大鼠心肌延遲再灌注時(shí)間的篩選 選取心肌缺血模型大鼠42只，分別于缺血1 h（n=6）、4 h（n=10）、6 h（n=10）、12 h（n=10）、24 h（n=6）后重新開(kāi)胸并打開(kāi)線結(jié)，使心肌再灌注15～20 s，以前壁心肌顏色恢復(fù)、5 min內(nèi)ST段回落超過(guò)50%判斷為再灌注成功。

1.4 動(dòng)物分組與處理 取大鼠63只，分為假手術(shù)組17只、及時(shí)再灌組23只、延遲再灌組23只。及時(shí)再灌組和延遲再灌組按照1.2方法制備心肌缺血模型，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。及時(shí)再灌組于缺血1 h、延遲再灌組于缺血4 h后，拆開(kāi)縫線，打開(kāi)線結(jié)，再灌注15～20 s。按1.3方法判斷為再灌注成功后，逐層縫合胸腔。

1.5 大鼠心肌缺血面積測(cè)算 采用TTC/Evens Blue雙染色法。及時(shí)再灌組、延遲再灌組各取6只大鼠，再灌注24 h后于升主動(dòng)脈根部注射10%伊文思藍(lán)1.5～2.0 mL?？焖偾谐呐K，以預(yù)冷的PBS沖洗，在30 mmol/L KCl溶液中停跳后，-20℃冷凍15 min。自結(jié)扎水平將心臟橫切成1 mm厚切片，加入1%TTC溶液，37℃溫育10～15 min。缺血區(qū)包括紅染的危險(xiǎn)區(qū)及白色的壞死區(qū)，藍(lán)染的正常區(qū)。相機(jī)（Canon EOS 800D，600 dpi）拍照并采用Image J軟件分析危險(xiǎn)區(qū)面積（AAR）、梗死區(qū)面積（IA）、左心室總面積（LV），分別以（IA+AAR）/LV表示缺血區(qū)、IA/AAR表示壞死區(qū)、AAR/LV表示危險(xiǎn)區(qū)大小。

1.6 大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌細(xì)胞凋亡情況觀察 采用改進(jìn)TUNEL法［4］。三組各取3只大鼠，再灌注24 h后處死。取結(jié)扎點(diǎn)下2 mm處心肌橫斷面，石蠟包埋，切100 μm厚切片。加入40 g/L多聚甲醛固定，2 mg/mL蛋白酶K溶液通透樣本；加入450 μL熒光素片段末端標(biāo)記反應(yīng)混合物以及50 μL TdT酶行標(biāo)記反應(yīng)，封片并激發(fā)，在綠色熒光濾片下觀察標(biāo)記的紅色熒光凋亡細(xì)胞。先在低倍鏡下選擇缺血危險(xiǎn)區(qū)，然后在高倍鏡下選擇3個(gè)視野進(jìn)行熒光拍照，采用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率［5］。

1.7 大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3檢測(cè) 三組各取6只大鼠，再灌注24 h后處死。取缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織1 mg剪碎，加入蛋白裂解酶裂解，離心取上清，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。煮沸變性后，SDS-PAGE電泳；采用10%分離膠，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。加入一抗（稀釋濃度：GAPDH為1∶5 000，Bax、Bcl-2均為1∶500，Cleaved Caspase-3為1∶1 000），孵育過(guò)夜。加入二抗（稀釋濃度1∶5 000）孵育，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法自動(dòng)曝光并保存。用Image J軟件計(jì)算蛋白灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 大鼠左心室形態(tài)及功能檢查 三組各取8只大鼠，再灌注72 h后行M型心臟超聲檢查。在左心室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左心室收縮末直徑（LVDs）、左心室舒張末直徑（LVDd）、左心室短軸縮短率（FS），在四腔心切面計(jì)算左心室收縮末容積（LVDsV）、左心室舒張末容積（LVDdV）；Simpson′s法計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、每搏射血量（SS）和心輸出量（CO）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌延遲再灌注時(shí)間的篩選結(jié)果 缺血12 h及24 h后再灌注，心肌顏色固定無(wú)恢復(fù)、心電圖示心肌梗死Q波形成，提示無(wú)法成功再灌注；缺血6 h后再灌注，僅2只大鼠成功再灌注；缺血4 h后再灌注，LAD可自行開(kāi)通，心肌顏色恢復(fù)，心電圖ST段回落；缺血1 h后再灌注，心肌顏色恢復(fù)，ST段回落并伴有心率恢復(fù)或室性早搏等心律失常表現(xiàn)。故將缺血1 h后再灌注作為及時(shí)再灌注時(shí)間，缺血4 h后再灌注作為延遲再灌注時(shí)間。

2.2 及時(shí)再灌組與延遲再灌組大鼠心肌缺血情況比較 見(jiàn)表1。

表1 及時(shí)再灌組與延遲再灌組大鼠心肌缺血情況比較（）

表1 及時(shí)再灌組與延遲再灌組大鼠心肌缺血情況比較（）

注：與及時(shí)再灌組比較，*P＜0.05。

images/BZ_24_1284_1519_2243_1578.png延遲再灌組及時(shí)再灌組0.29±0.05 0.35±0.14 6 6 0.58±0.26*0.35±0.11 0.54±0.03*0.42±0.12

2.3 三組大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率比較假手術(shù)組、及時(shí)再灌組、延遲再灌組心肌細(xì)胞凋亡率分別為2.1%±0.3%、6.4%±1.2%、10.7%±1.7%，及時(shí)再灌組、延遲再灌組心肌細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，延遲再灌組高于及時(shí)再灌組（P均＜0.01）。

2.4 三組大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌組織Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（-x± s）

2.5 三組大鼠左心室形態(tài)及功能比較 見(jiàn)表3。

表3 三組大鼠左心室形態(tài)及功能指標(biāo)比較（）

表3 三組大鼠左心室形態(tài)及功能指標(biāo)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與及時(shí)再灌組比較，#P＜0.01。

組別延遲再灌組及時(shí)再灌組假手術(shù)組CO（mL/min）29.20± 2.91*30.87± 7.35*59.54±19.94 n 8 8 8 LVDs（mm）5.05±0.86*4.41±0.65 4.02±0.78 LVDd（mm）6.31±0.57 5.81±0.61*6.71±1.10 LVDsV（μL）125.37±45.04*#90.60±31.32 74.38±26.40 LVDdV（μL）203.61±40.87 169.77±37.41*239.74±81.47 FS（%）20.36±7.27*24.35±5.83*40.39±6.22 LVEF（%）40.17±12.23*#47.27± 9.36*69.36± 7.32 SS（μL）78.24± 9.76*79.16±19.98*165.37±58.91

3 討論

良好的動(dòng)物模型是開(kāi)展基礎(chǔ)研究的前提和關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)選取具有基因背景清楚、冠狀動(dòng)脈側(cè)支少、心肌壞死出現(xiàn)早及重復(fù)率高等優(yōu)勢(shì)的SD大鼠作為心肌IRI建模動(dòng)物。我們發(fā)現(xiàn)，心肌持續(xù)缺血4 h后自行開(kāi)通率較高、重復(fù)性好，可以從組織細(xì)胞分子及心臟形態(tài)功能等層面較好地模擬心肌延遲IRI。實(shí)驗(yàn)采用呼吸機(jī)輔助通氣下原位心臟血管結(jié)扎致心肌缺血，既避免因心臟擠壓至胸腔外影響心臟泵功能及心電，又避免因多次牽拉導(dǎo)致造模失敗。在模型制作過(guò)程中，結(jié)扎過(guò)程是關(guān)鍵。采用較粗的6-0無(wú)創(chuàng)縫線［6］作為結(jié)扎線可以減少心肌損傷；依據(jù)可視血管走行及相對(duì)解剖結(jié)構(gòu)判斷進(jìn)出針位置，進(jìn)針的深度及寬度盡量保持一致，盡量一次成功以保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。結(jié)扎松緊度也影響實(shí)驗(yàn)的效果，過(guò)緊易導(dǎo)致血管斷裂、心肌損傷，過(guò)松易造成不完全缺血。所以，我們選擇有一定柔軟度的橡皮筋作為壓迫LAD 的介質(zhì)，避免用縫線［7］或聚乙烯管［8］等硬壓迫物對(duì)血管造成損傷的可能，且容易取出。這樣不僅可以通過(guò)壓痕及心肌顏色變化控制張力，還可以有效避免縫線對(duì)LAD血管的直接切割損傷，對(duì)有效再灌注起積極作用。

在延遲缺血時(shí)間的摸索中，我們?cè)鴩L試術(shù)前腹腔注射肝素50 IU/100 g抗凝以延長(zhǎng)缺血時(shí)間；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)野滲血明顯可影響觀察心肌顏色變化，大鼠胸腔內(nèi)積血或氣管內(nèi)出血明顯可導(dǎo)致大鼠窒息死亡。與心肌酶譜、心臟超聲、心肌磁共振相比，TTC/Evens Blue雙染色具有經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)比性好的優(yōu)勢(shì)，是評(píng)估再灌注損傷應(yīng)用最多的檢測(cè)方法。本研究發(fā)現(xiàn)，TTC/Evens Blue雙染色可較好標(biāo)示缺血梗死區(qū)、危險(xiǎn)區(qū)及正常區(qū)，延遲再灌組壞死區(qū)、缺血區(qū)均較及時(shí)再灌組增大，且兩組均有明顯的危險(xiǎn)區(qū)。這提示兩組具備典型的IRI組織學(xué)表現(xiàn)，而延遲再灌組可更好地模擬臨床心肌延遲IRI。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞一種可調(diào)控的死亡過(guò)程，調(diào)控或干預(yù)凋亡過(guò)程是一種有效挽救心肌的方法［9］。對(duì)于處于非致死性刺激（如缺血邊緣區(qū)）的心肌細(xì)胞，凋亡是一種主要的病理改變過(guò)程［10］。心肌細(xì)胞凋亡率越高則梗死后心力衰竭的概率越大，且缺血再灌注時(shí)較單純?nèi)毖l(fā)生的細(xì)胞凋亡比例更高［11-12］。在心肌IRI中細(xì)胞凋亡起著舉足輕重的作用，抑制細(xì)胞凋亡是降低IRI的治療策略。線粒體參與調(diào)控細(xì)胞凋亡［13-14］，而內(nèi)源性線粒體途徑在心肌IRI細(xì)胞凋亡中起主要的調(diào)控作用［15］。Caspase-3作為核心執(zhí)行蛋白參與線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡過(guò)程，而Cleaved Caspase-3可反映其活性高低。凋亡執(zhí)行蛋白中，Bax有明確的促凋亡作用，而B(niǎo)cl-2有明確的抑制凋亡作用［16］，兩者比值可有效反映細(xì)胞凋亡的程度。本研究結(jié)果顯示，及時(shí)再灌組、延遲再灌組缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，延遲再灌組高于及時(shí)再灌組；及時(shí)再灌組和延遲再灌組Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組，及時(shí)再灌注組Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)高于延遲再灌組，三組Bcl-2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示兩組具備典型的IRI細(xì)胞分子學(xué)表現(xiàn)，而延遲再灌組可更好地模擬臨床心肌延遲IRI。

心肌IRI發(fā)生后，心肌組織缺血壞死和心肌細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致心臟形態(tài)與功能的改變。本研究采用結(jié)扎心臟LAD造模，對(duì)左心室形態(tài)和功能的影響最明顯。再灌注72 h，采用動(dòng)物超聲儀檢查左心室形態(tài)及功能指標(biāo)；結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，延遲再灌組和及時(shí)再灌組FS、SS、LVEF、CO均下降，且延遲再灌組LVDsV、LVEF均低于及時(shí)再灌組。這進(jìn)一步提示延遲再灌組心肌形態(tài)及收縮功能受損更明顯，可更好地模擬臨床心肌延遲IRI。

綜上所述，SD大鼠心肌缺血4 h后再灌注自行開(kāi)通率較高、重復(fù)性好，并可引起凋亡蛋白表達(dá)異常，從而導(dǎo)致明顯的心肌細(xì)胞凋亡及左心室收縮功能下降，表明該模型可以從組織細(xì)胞分子及心臟形態(tài)功能等層面較好地模擬臨床心肌延遲IRI。