莫蕊辰，王娓娓，趙磊，牟林茂

1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250000；2山東省立醫(yī)院

支氣管哮喘是最常見的氣道慢性炎癥性疾病之一，患者發(fā)作時可出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，伴隨反復(fù)發(fā)作性的喘息、氣促、胸悶或咳嗽，若診治不及時可產(chǎn)生不可逆性氣道狹窄和氣道重塑，急性發(fā)作甚至危及生命。目前西醫(yī)對支氣管哮喘的主要治療模式為階梯治療方案，根據(jù)患者的病情嚴(yán)重程度和控制水平選擇相應(yīng)的治療級別。但該方案中激素的應(yīng)用對部分患者病情控制效果不佳，且長期應(yīng)用激素不良反應(yīng)大，容易產(chǎn)生依賴。中醫(yī)治療支氣管哮喘有完整的辨證論治體系與用藥規(guī)律，并具有一定優(yōu)勢，可以提高支氣管哮喘患者第1秒通氣量和用力肺活量［1］。桔梗是經(jīng)典的止咳、平喘類藥物，能有效改善和預(yù)防支氣管癥狀。但目前研究多集中于對桔梗單體成分作用機(jī)制的研究，尚未明確桔梗治療支氣管哮喘的靶點及具體通路。2019年11月—2020年10月，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘桔梗與支氣管哮喘的相關(guān)靶點及通路，探討桔梗治療支氣管哮喘潛在的作用機(jī)制，以期為支氣管哮喘中醫(yī)藥臨床用藥提供有價值的理論參考。

1 材料與方法

1.1 桔?；瘜W(xué)成分收集和篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）查詢桔梗，獲得桔梗的有效成分。以口服生物利用度（OB）≥10%、化合物類藥性（DL）≥0.18對桔梗有效成分進(jìn)行篩選，得到符合條件的化學(xué)成分。

1.2 桔梗成分作用靶點收集及可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（Pubchem）中輸入篩選后的桔梗有效成分，得到化學(xué)成分的部分靶點、表示化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的Canonical SMILES序列及化學(xué)成分的2D/3D結(jié)構(gòu)，剔除既沒有靶點也沒有序列的成分，即得到桔梗的最終有效成分；將得到的部分靶點以人類物種（編號9606）和活性（active）進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將Pubchem獲得的Canonical SMILES序列輸入Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以Probability≥0.1為篩選條件，得到部分桔梗靶點。將兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點合并，以uniport ID為標(biāo)準(zhǔn)去重復(fù)得到桔梗的最終靶點。將最終靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.2軟件制作有效成分與相關(guān)作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件的Tools模塊，得到“桔?！行С煞帧饔冒悬c”網(wǎng)絡(luò)參數(shù)。其中一個靶點Degree值代表了與該靶點直接發(fā)生作用的靶點數(shù)目，靶點的Degree值越大，說明該靶點的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)。設(shè)定Degree值≥3，得到桔梗中發(fā)揮相對重要作用的成分及靶點并對其進(jìn)行可視化處理。

1.3 支氣管哮喘靶點收集和篩選 將asthma分別輸入治療靶點數(shù)據(jù)庫（TTD）、Drugbank數(shù)據(jù)庫、疾病基因綜合數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（CTD）、genecards數(shù)據(jù)庫、在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、GAD數(shù)據(jù)庫、京都基因和基因組合百科全書（KEGG）獲得各數(shù)據(jù)庫的支氣管哮喘靶點。將以上數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果合并、去重復(fù)，獲得支氣管哮喘的已知靶點，檢索時限為2019年12月25日。由于數(shù)據(jù)庫繁雜，不同數(shù)據(jù)庫中獲得的基因難以對應(yīng)，故利用Uniport數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白—基因名標(biāo)準(zhǔn)化，將蛋白名轉(zhuǎn)化為基因名。

1.4 桔梗治療支氣管哮喘靶點蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將桔梗靶點與支氣管哮喘靶點取交集、去重復(fù)，得到桔梗治療支氣管哮喘的預(yù)測靶點。將預(yù)測靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)定為Homo snpiens，獲得桔梗治療支氣管哮喘靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。將獲取到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.6.2軟件中，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化處理，其中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點即靶點、邊的信息即蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，節(jié)點大小根據(jù)Degree值確定，Degree值越大，節(jié)點越大。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治雠c核心靶點獲取 在Cytoscape3.6.2軟件中利用Tools模塊中的Network Analyzer插件，對桔梗治療支氣管哮喘靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，可得到自由度、介數(shù)、接近中心性、平均最短路徑長度等拓?fù)湎嚓P(guān)參數(shù)。利用apps模塊中的cytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行核心靶點拓?fù)?，得到桔梗映射到支氣管哮喘上的核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖，其中越關(guān)鍵的靶點顏色越紅。

1.6 核心靶點的GO功能富集與KEGG通路分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫將獲取的核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路分析，以P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行升序排列，取排名前10的結(jié)果對桔梗治療支氣管哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 桔梗有效成分獲取結(jié)果 在TCMSP中共查詢到桔梗有效成分130種，其中符合OB≥10%的成分52種、符合DL≥0.18的成分37種、符合OB≥10%且DL≥0.18的成分22種，符合篩選規(guī)則的22種成分包括刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷元等。見表1。

2.2 桔梗成分靶點及可視化網(wǎng)絡(luò)圖 在Pubchem中分別輸入篩選后的22個有效成分，其中5個成分有靶點，12個成分有Canonical SMILES序列，10個成分既沒有靶點也沒有序列，得到最終有效成分12個。Pubchem中共獲得3 680個靶點，經(jīng)篩選獲得212個靶點；Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫中共獲得1 100個靶點，經(jīng)篩選獲得590個靶點，兩個數(shù)據(jù)庫靶點合并、去重后共得到311個最終靶點。桔梗中發(fā)揮相對重要作用的成分為刺槐素、木犀草素、桔梗皂苷元、桔梗酸C等；發(fā)揮相對重要作用的靶點分別為 AKR1B10、CYP1B1、CYP1A1、NFKB1、POLB、ALOX5等。桔梗—有效成分—作用靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖見OSID碼圖1。

表1 桔梗有效成分

2.3 支氣管哮喘靶點獲取結(jié)果 將各個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果合并、去重復(fù)后，共得到1 551個支氣管哮喘靶點。

2.4 桔梗治療支氣管哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果將311個桔梗成分靶點與1 551個支氣管哮喘靶點合并、取交集、去重，共得到137個桔梗治療支氣管哮喘靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫得到桔梗治療支氣管哮喘的PPI網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)共包括137個節(jié)點，1 292個邊。桔梗治療支氣管哮喘靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見OSID碼圖2。

2.5 桔梗治療支氣管哮喘核心靶點獲取結(jié)果 共篩選出10個桔梗治療支氣管哮喘的核心靶點，包括半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、分裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體α（ESR1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、雄性激素受體（AR）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、MMP2、誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞分化蛋白（MCL1）。桔梗治療支氣管哮喘核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖見OSID碼圖3。

2.6 核心靶點的GO功能富集與KEGG通路分析結(jié)果 GO功能富集分析共得到GO條目77個，其中生物過程53個、分子功能13個、細(xì)胞組成11個，前10的結(jié)果中包含生物過程8個（分別為一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、蛋白磷酸化正調(diào)控、胚胎植入、平滑肌細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)、細(xì)胞對機(jī)械刺激的反應(yīng)、傷口愈合、對雌二醇的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控）、分子功能1個（核相關(guān)分子功能）、細(xì)胞組成1個（酶的綁定）。KEGG通路分析共得到KEGG通路35條，其中前10的通路依次為癌癥中的蛋白聚糖、癌癥通路、雌激素信號通路、酪氨酸激酶受體家族信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1信號通路、磷脂酰三磷酸肌醇—絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路、絲裂原激活的蛋白激酶信號通路、非小細(xì)胞癌、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路。

3 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測桔梗治療支氣管哮喘的作用機(jī)制，共篩選獲得桔梗治療支氣管哮喘的有效靶點137個，核心靶點10個，GO條目78個，KEGG通路35條。提示桔梗通過一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、蛋白磷酸化正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)等生物過程，以及ErbB、mTOR、HIF-1等信號通路來發(fā)揮對支氣管哮喘的治療作用

本研究對桔?！行С煞帧饔冒悬c的分析顯示，桔梗中的刺槐素、木犀草素可能是治療支氣管哮喘的關(guān)鍵成分。刺槐素是從刺槐中提取的一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎的功能，并且可以通過抑制巨噬細(xì)胞上TRAIL-R1死亡受體的表達(dá)水平來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。陳菲菲等［3］認(rèn)為，刺槐素可能通過抑制維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γt活化，減少CD4+CD62L+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化及IL-17的表達(dá)，從而降低中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，起到治療支氣管哮喘的作用。LI等［4］研究顯示，刺槐素可通過降低支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子INF-α和IL-2的水平來減輕肺組織病理損傷。木犀草素是從木犀草屬中提取的一種黃酮類化合物，分布較廣泛，具有抗腫瘤、抗炎、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等藥理作用。余潔等［5］研究顯示，木犀草素可以抑制支氣管哮喘患兒外周血單核細(xì)胞促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的分泌，其可能通過作用于TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)，對支氣管哮喘具有潛在的治療作用。趙長祺等［6］的實驗顯示，一定濃度（2.5、5、10 mg/L）的木犀草素能夠抑制T淋巴細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，其中10 mg/L木犀草素可能通過下調(diào)T淋巴細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)來影響線粒體凋亡通路。繆存靜等［7］認(rèn)為，木犀草素可以通過下調(diào)標(biāo)志蛋白E-鈣黏素表達(dá)，上調(diào)波形蛋白表達(dá)來逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時對肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。由上可見，桔梗中的刺槐素、木犀草素等有效成分，表現(xiàn)出抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用，可能做為關(guān)鍵成分參與到支氣管哮喘的治療中。

本 研 究 結(jié) 果 顯 示 ，CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9、MMP2等10個核心靶點在桔梗治療支氣管哮喘中發(fā)揮了重要作用。氣道炎癥、氣道重塑目前被認(rèn)為是支氣管哮喘本質(zhì)的病理機(jī)制，其中炎癥介質(zhì)以及細(xì)胞凋亡的參與十分重要，而CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9都是參與上述變化的典型因子。CASP3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵一環(huán)，當(dāng)細(xì)胞線粒體膜損傷，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素釋放到細(xì)胞外，可激活CASP3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時，CASP3還可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，參與支氣管哮 喘 氣 道 重 塑 的 過 程［8］。VALLESE 等［9］發(fā) 現(xiàn) ，MAPK3的亞型p38 MAPK在支氣管哮喘患者氣道黏膜下層高度表達(dá)，對體外支氣管上皮細(xì)胞刺激后，p38 MAPK mRNA升高。其引起氣道炎癥的機(jī)制為氣道上皮細(xì)胞被刺激后，p38 MAPK活化，可導(dǎo)致炎癥介質(zhì)IL-8、TNF-α等釋放；p38 MAPK還參與上呼吸道病毒感染引起的炎癥反應(yīng)，在支氣管哮喘急性加重期起重要作用［10］。研究顯示，p38 MAPK與線粒體細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)，抑制其活化可能減少氣道平滑肌細(xì)胞增生，抑制氣道重塑［11］。桔?？赡茏鳛閜38 MAPK抑制劑，通過抑制其活化減少炎癥因子的分泌，對氣道炎癥發(fā)揮作用。此外，EGFR及其配體表達(dá)于氣道上皮，調(diào)節(jié)氣道上皮修復(fù)，參與氣道重塑與氣道黏液高分泌。李曉輝等［12］研究結(jié)果顯示，EGFR抑制劑可能通過下調(diào)EGFR的表達(dá)、抑制依賴于EGFR下游的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)來緩解支氣管哮喘氣道重塑過程。張沄等［13］發(fā)現(xiàn)，許多刺激黏液產(chǎn)生的刺激物通過增加細(xì)胞膜表面MMPs來裂解和活化EGFR的上游受體，而EGFR的表達(dá)與氣道黏液杯狀細(xì)胞病理性增生存在正相關(guān)性，因此抑制EGFR的表達(dá)可以減少黏液高分泌導(dǎo)致的氣道受阻。在MMPs家族中，MMP9是誘導(dǎo)氣道重塑的重要因子，MMP9與其抑制物TIMP1的失衡會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解，降解產(chǎn)物在黏膜下層堆積會導(dǎo)致氣道壁增厚，加速氣道重塑過程［14-15］。由上可見，導(dǎo)致氣道炎癥、氣道重塑的CASP3、MAPK3、EGFR、MMP9等因子，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放、增加氣道黏液高分泌等過程推動了氣道炎癥反應(yīng)，影響并加速氣道重塑，且上述因子不僅存在多途徑、多通路介導(dǎo)同一病理變化的情況，還存在相互介導(dǎo)、協(xié)調(diào)的關(guān)系，構(gòu)成了復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，桔梗治療支氣管哮喘主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、蛋白磷酸化正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)、細(xì)胞對機(jī)械刺激的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等多個環(huán)節(jié)。KEGG通路富集結(jié)果顯示，ErbB信號通路、mTOR信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等可能是桔梗治療支氣管哮喘的關(guān)鍵通路。ErbB存在多種配體與靶基因，ErbB信號通路通過EGFR等受體與表皮細(xì)胞生長因子、雙向調(diào)節(jié)蛋白等配體相結(jié)合后，激活MAPK等下游相關(guān)基因來調(diào)控細(xì)胞增殖等活動，而細(xì)胞增殖貫穿支氣管哮喘氣道重塑過程的始終。HIF-1是一種氧依賴性轉(zhuǎn)錄激活因子，主要在缺氧條件下表達(dá)。文獻(xiàn)表明，HIF-1信號通路與其他信號通路間存在交叉調(diào)節(jié)，同時也是多條信號通路的必經(jīng)環(huán)節(jié)。王莉等［16］發(fā)現(xiàn)，mTOR、4EBP1、HIF-1、VEGF信號通路在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要協(xié)同作用。上游mTOR信號通路被激活后，HIF-1表達(dá)上調(diào)，作為HIF-1的下游因子VEGF表達(dá)隨之上調(diào)，其信號通路也被激活，這一過程使得嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞聚集、浸潤于氣道，引起氣道高反應(yīng)的同時損傷氣道上皮細(xì)胞，且在炎癥刺激下氣道壁血管通透性增加，氣道壁組織充血水腫，氣道變窄，從而加速支氣管哮喘的進(jìn)展。此外，與細(xì)胞增殖、凋亡及氣道重塑有關(guān)的PI3K-Akt和MAPK因子在缺氧的條件下，也可成為HIF-1信號通路的上游，激活HIF-1信號通路［17］。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對桔梗治療支氣管哮喘的潛在作用機(jī)制進(jìn)行多成分、多靶點、多通路的分析。桔梗中的有效成分可能通過調(diào)控CASP3、MAPK3、EGFR等關(guān)鍵靶點作用于mTOR、HIF-1、VEGF等信號通路，整體協(xié)同發(fā)揮抗炎、抑制氣道重塑的作用。由于本研究未對有效成分、作用靶點、信號通路中的各環(huán)節(jié)進(jìn)行權(quán)重，可能會影響網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的精確度，所以獲得的靶點和通路還需要實驗來進(jìn)一步驗證。