李曉明，李作鹽，石坷，林大永

遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)鐵煤總醫(yī)院，遼寧鐵嶺112700

肺纖維化（PF）是一種慢性肺部疾病，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過(guò)度積累，細(xì)胞外膠原異常沉積，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致肺的順應(yīng)性降低，最終發(fā)生肺功能障礙［1-2］。PF既可由病毒感染、放療暴露、化療藥物損傷或霧化環(huán)境毒素?fù)p害等引發(fā)，也可由類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或系統(tǒng)性硬化等結(jié)締組織病或免疫系統(tǒng)疾病并發(fā)。在肺纖維化形成過(guò)程中，有多種信號(hào)通路的參與，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化具有關(guān)鍵性作用。PF患者預(yù)后極差，確診后生存期僅為2.5～3.5年［3］。雖然近年來(lái)在PF的藥物治療上取得了一定的進(jìn)展，如nintedanib和pirfenidone等生物制劑能夠延緩PF進(jìn)展［4-5］，但不良反應(yīng)較為突出，限制了其臨床應(yīng)用。PF在中醫(yī)學(xué)上屬于肺痿、肺痹范疇，與肺氣虛弱、氣血瘀滯有關(guān)，多采取益氣活血方劑進(jìn)行治療。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是中醫(yī)名方，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效，可治療半身不遂之中風(fēng)，臨床發(fā)現(xiàn)其對(duì)PF亦具有較好效果。2020年4月—5月，我們觀(guān)察了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠PF的抑制作用，并通過(guò)TGF-β/Smads通路活性變化進(jìn)一步探討其治療的機(jī)制，為該方的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及儀器 補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎劑（生黃芪120 g、當(dāng)歸尾 3 g、赤芍 5 g、地龍 3 g、川芎 3 g、紅花3 g、桃仁3 g，水煎后去渣，濃縮至含生藥1 g/mL），博萊霉素（天津太和制藥有限公司）；RNA抽提試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）第一鏈合成試劑盒（南京建成生物工程研究所），TGF-β、p-Smad3一抗（武漢博士德公司），RIPA蛋白裂解液及白蛋白（BSA）定量試劑盒（浙江碧云天生物試劑公司），Pro-Flex型PCR儀（賽默飛世爾公司），EUROBlotMaster自動(dòng)免疫印跡分析儀（德國(guó)歐蒙公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組 雄性SD大鼠，5～6周齡，體質(zhì)量110～130 g，清潔級(jí)，購(gòu)于中國(guó)上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；于室溫、50%～70%濕度環(huán)境中飼養(yǎng)，定量喂食，自由飲水；所有操作符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，盡量減少動(dòng)物痛苦；將大鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，取36只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組及干預(yù)組，每組12只，分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物造模與藥物干預(yù) 模型組及干預(yù)組用博來(lái)霉素誘導(dǎo)PF模型，對(duì)照組不造模。三組采用2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于動(dòng)物解剖臺(tái)；消毒，頸部正中切開(kāi)，顯露氣管；模型組及干預(yù)組向氣管內(nèi)注入5 mg/L博來(lái)霉素溶液0.3 mL，對(duì)照組注入等體積生理鹽水；注入后翻轉(zhuǎn)動(dòng)物，使藥物在肺部均勻分布。將大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，定量喂食；大鼠出現(xiàn)活動(dòng)力下降，撓鼻、咳嗽等呼吸道癥狀表示造模成功。造模1周后干預(yù)組每日以補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎劑4 g/kg灌胃，2次/天；模型組和對(duì)照組每日以等體積生理鹽水灌胃，使用方法同干預(yù)組。各組均連續(xù)給藥1周。

1.2.3 肺組織標(biāo)本采集 大鼠造模1周后，斷頭法處死。消毒開(kāi)胸，解剖分離肺組織；取左肺放入DEPC水中處理后以甲醛固定，脫水后常規(guī)石蠟包埋；取右肺上中葉保存于冷凍管中，迅速置于液氮中備用。

1.2.4 肺組織病理學(xué)觀(guān)察及肺泡炎癥、PF程度評(píng)價(jià) 肺組織病理切片行HE染色和Masson染色，光鏡下觀(guān)察病理組織學(xué)變化并攝片，參照Szapiel方法評(píng)價(jià)大鼠肺泡炎癥反應(yīng)程度及PF程度。肺泡炎癥程度評(píng)分：0分為肺泡腔內(nèi)無(wú)炎癥滲出，肺組織結(jié)構(gòu)正常；1分為肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)單核細(xì)胞滲出，局部可見(jiàn)肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)病變面積＜20%，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常；2分為肺泡內(nèi)可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞，肺間質(zhì)病變面積20%～50%；3分為肺泡腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞或?qū)嵶?，肺間質(zhì)病變面積＞50%。PF程度評(píng)分：0分為無(wú)PF；1分為輕度，PF病變面積＜20%；2分為中度，PF病變面積20%～50%；3分為重度，PF病變面積＞50%。

1.2.5 肺組織TGF-β、Smad3 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。肺組織標(biāo)本解融，剪碎后研磨，制備勻漿；TRIzol法提取總RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別在280、260 nm波長(zhǎng)下，采用分光光度計(jì)法計(jì)算RNA原液濃度和OD260/OD280。根據(jù)RNA原液濃度以及試劑盒說(shuō)明調(diào)整RNA濃度，使RNA稀釋液濃度為500 ng/μL。按試劑盒要求配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為37℃15 min、85℃5 s，4℃保存。合成的cDNA于-20℃保存。引物序列：TGF-β上游引物 5′-GTTCCTGCCATTCTGGTGCA-3′、下游引物 5′-TGCGTGTCAGGGGTTGGTTAC-3′，Smad3 上 游 引 物 5′-CTACCGACTGCGAGGCATAA-3'、下游引物5'-CGAGCCGATACATCGATCCT-3'，內(nèi)參GAPDH上游引物5'-CAGATGCTCGCAAGGTAGGA-3′、下游引物5′-ACAGAAGTAGTACGCAGACTG-3′。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95℃ 2 min預(yù)變性；95℃ 15 s變性，60℃ 1 min退火，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s、60℃15 s延伸。使用ABI Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行三次反應(yīng)，通過(guò)2－ΔΔCt分析TGF-β、Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白檢測(cè) 采用免疫印跡法。將深低溫保存的肺組織于液氮中充分研磨，用RIPA溶解緩沖液在冰上提取肺組織蛋白；以離心半徑15 cm、12 000 r/min離心5 min，吸取上清液；加入苯基甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑，采用Bradford法測(cè)定樣品蛋白濃度。在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離出每個(gè)樣品中等量的蛋白（50 mg），轉(zhuǎn)移到直徑0.22 μm的硝化纖維素濾膜上；滴加TGF-β（1∶1 000）、p-Smad（1∶1 000）和 β-actin（1∶3 000）一抗，4℃下?lián)u床溫育過(guò)夜；滴加山羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育1 h，沖洗后加入ECL發(fā)光液。采用美國(guó)Pierce、Rockford等超級(jí)信號(hào)Western Pico化學(xué)發(fā)光基板，用Quantity One軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行可視化處理，以目的蛋白與內(nèi)參光密度比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化 HE染色顯示，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)間隔水腫、肺泡可見(jiàn)少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉積；模型組肺組織炎癥反應(yīng)明顯，肺泡內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞滲出，成纖維細(xì)胞增生，形成大面積纖維化病灶；干預(yù)組肺組織炎癥反應(yīng)較為明顯，肺泡內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞滲出，肺組織可見(jiàn)成纖維細(xì)胞增生，部分區(qū)域可見(jiàn)纖維化病灶。

2.2 各組大鼠肺泡炎癥及PF程度比較 大鼠肺泡炎癥評(píng)分及PF評(píng)分模型組高于對(duì)照組，而干預(yù)組低于模型組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺泡炎癥評(píng)分、PF評(píng)分比較（分，）

表1 各組大鼠肺泡炎癥評(píng)分、PF評(píng)分比較（分，）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

images/BZ_42_234_2378_1193_2437.png干預(yù)組模型組對(duì)照組12 12 12 FP 1.38±0.56*#2.43±0.29*0.14±0.41 18.533 0.003 1.26±0.61*#2.32±0.21*0.26±0.02 26.112 0.002

2.3 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達(dá)比較 大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達(dá)水平模型組高于對(duì)照組，而干預(yù)組低于模型組（P均＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達(dá)比較 肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達(dá)水平模型組高于對(duì)照組，而干預(yù)組低于模型組（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達(dá)比較（）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

images/BZ_42_1284_403_2243_462.png干預(yù)組模型組對(duì)照組12 12 12 FP 0.83±1.05#0.94±0.12*0.73±0.61 19.362 0.003 0.37±0.15#0.42±0.12*0.34±0.15 22.123 0.001

表3 各組大鼠肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組大鼠肺組織TGF-β、p-Smad3蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

images/BZ_42_1284_904_2243_963.png干預(yù)組模型組對(duì)照組12 12 12 FP 0.34±0.09#0.79±0.01*0.28±0.01 25.118 0.002 0.44±0.09#0.78±0.01*0.39±0.03 25.693 0.003

3 討論

PF是由各種原因所致肺組織細(xì)胞外基質(zhì)聚集、炎性損傷及間質(zhì)纖維細(xì)胞增殖，最終引起PF；肺組織的順應(yīng)性下降，同時(shí)伴有肺泡結(jié)構(gòu)的損傷，肺的通氣及換氣功能障礙，最終導(dǎo)致呼吸功能下降或衰竭。PF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎性損傷、免疫反應(yīng)及遺傳學(xué)因素等均參與PF的過(guò)程。雖然，近年來(lái)PF的臨床治療取得了一定進(jìn)展，但臨床療效仍不理想，大部分患者最終會(huì)進(jìn)展為呼吸功能衰竭，預(yù)后極差。PF發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是肺實(shí)質(zhì)纖維組織過(guò)度增生，與細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞因子、信號(hào)通路和PF的發(fā)生密切相關(guān)，如在PF過(guò)程中TGF-β/Smad3信號(hào)通路的激活。TGF-β通過(guò)激活其受體觸發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，從而觸發(fā)Smads磷酸化［7］；磷酸化后Smad2、Smad3與Smad4形成異構(gòu)體復(fù)合物，復(fù)合體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并打開(kāi)基因轉(zhuǎn)錄，因此抑制Smads能夠降低TGF-β信號(hào)通路的活性。Smad3特異性抑制劑SIS3可抑制Smad3的磷酸化，可以抑制TGF-β處理的人真皮成纖維細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞分化和膠原生成，可通過(guò)抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路來(lái)改善纖維化、凋亡和炎癥反應(yīng)［8］；此外，SIS3能夠通過(guò)抑制上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和纖維化延緩1型糖尿病小鼠模型糖尿病腎病的早期發(fā)展［9］。這些研究表明，抑制 TGF-β/Smad3信號(hào)通路功能及活性可能在纖維化相關(guān)疾病的治療中具有重要作用［10-11］。

中醫(yī)學(xué)對(duì)PF的治療由來(lái)已久，多從肺痿、肺痹施治。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺臟虛損，津氣耗傷，血脈瘀阻，以致肺葉枯萎。肺痿屬內(nèi)傷虛證，病情較重且遷延難愈，因此中醫(yī)多采用補(bǔ)氣活血功效的方劑進(jìn)行治療。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有益氣、活血、通絡(luò)的作用，在氣虛血瘀所致胸痛、痹癥等治療中具有極其重要的臨床價(jià)值。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯方劑具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的PF大鼠模型肺組織發(fā)生明顯的肺泡炎癥及纖維化等改變，但在采用補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)的干預(yù)組大鼠肺泡炎癥及PF評(píng)分均明顯低于模型組，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠PF模型的肺部炎癥損害和纖維組織增生；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織TGF-β、Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，而干預(yù)組TGF-β、Smad3 mRNA及蛋白上調(diào)水平低于模型組。這說(shuō)明TGF-β/Smad3信號(hào)通路激活參與PF的過(guò)程，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路中Smad3的磷酸化過(guò)程，進(jìn)而降低TGF-β/Smad3信號(hào)通路活性，發(fā)揮抑制肺部炎癥反應(yīng)及PF的作用。既往研究表明表明，TGF-β/Smads信號(hào)通路在PF的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，養(yǎng)陰益氣合劑對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，提示具有補(bǔ)益作用的中藥對(duì)PF具有治療作用［13］。在纖維細(xì)胞活化及增殖過(guò)程中，TGF-β信號(hào)通路激活是導(dǎo)致組織或臟器纖維化的原因之一；其能通過(guò)上調(diào)氧化因子、金屬?gòu)椥缘鞍酌敢约耙种萍?xì)胞凋亡等途徑加速纖維細(xì)胞的沉積［14-17］，對(duì)其誘導(dǎo)纖維化過(guò)程的細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)活性進(jìn)行干預(yù)是防治PF的有效途徑［18］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯含有黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎等有效成分。既往研究顯示［19-20］，黃芪中的多糖組分能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)通路對(duì)百草枯誘導(dǎo)的大鼠PF發(fā)揮拮抗作用；同時(shí)，也能通過(guò)抑制mTOR及其下游p-S6的表達(dá)，影響α平滑肌肌動(dòng)蛋白生成，干預(yù)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠PF發(fā)生。當(dāng)歸中多糖、當(dāng)歸醇等組分能通過(guò)抑制TGF-β、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，延緩博來(lái)霉素誘導(dǎo)的PF大鼠模型肺部病變的進(jìn)展。以上研究提示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的藥物組分對(duì)PF的調(diào)節(jié)可能通過(guò)多途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠減輕PF大鼠肺組織炎癥及纖維化程度，可能與其抑制肺組織TGF-β/Smad3信號(hào)通路中TGF-β蛋白表達(dá)同時(shí)降低Smad3磷酸化水平有關(guān)，這為臨床應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療PF提供了一定的理論支持。