孟 岑，徐 剛

0 引言

急性淋巴細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是最常見的一種兒童惡性腫瘤,其死亡率在兒童惡性腫瘤中居首位，嚴重威脅著兒童的生命[1]。目前，ALL主要的治療方式為化學治療，其中甲氨蝶呤是關(guān)鍵藥物之一。在ALL的維持治療和髓外防治中，大劑量甲氨蝶呤(High-dose methotrexate,HD-MTX)的應用對疾病的治療起到了非常重要的作用。

甲氨蝶呤是一種葉酸抑制劑，對二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)的親和性更高，可與二氫葉酸競爭，使其無法還原成有活性的四氫葉酸，而四氫葉酸的缺乏會使DNA、RNA的合成過程受阻，進而影響腫瘤細胞快速增殖，導致其死亡。MTX進入細胞主要通過溶質(zhì)載體(SLC) 19A1轉(zhuǎn)運體(RFC1)介導，MTX進入細胞后，經(jīng)過由多種代謝酶參與的復雜的代謝后，由ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP-binding cassete，ABC)泵出。包括ABCB1和ABCC1-4等8個亞家族，其中ABCB1又名多藥耐藥基因1(MDR1)，ABCB1基因的編碼產(chǎn)物是P-糖蛋白,能夠介導甲氨蝶呤的外向排出，阻礙藥物的吸收[2]。

MTX可引起多種不良反應，如肝臟毒性、腎臟毒性、血液毒性及皮膚黏膜毒性等，其中肝臟毒性最為常見。在臨床應用中，其療效與不良反應存在個體差異，其機制尚不明確。有研究認為，這種多樣性可能和參與藥物代謝、轉(zhuǎn)運的基因序列改變有關(guān)[3]。目前，研究者對MTX代謝酶相關(guān)的基因多態(tài)性與其化療不良反應之間的關(guān)系進行了研究，但結(jié)論未能達成一致。

本文選取2015年8月至2019年6月于我院小兒血液內(nèi)科住院治療的ALL患兒為研究對象，通過檢測患兒ABCB1基因多態(tài)性，并監(jiān)測其甲氨蝶呤治療后的不良反應及血漿MTX濃度，探討兩者之間是否存在相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年8月至2019年6月于我院小兒血液內(nèi)科住院治療的ALL患兒132例，選取的患兒需完善骨髓穿刺并根據(jù)形態(tài)學(M)、免疫學(I)、細胞遺傳學(C)及細胞分子生物學(M)檢測并確診為ALL患者。按照《兒童急性淋巴細胞白血病診療規(guī)范(2018版)》的危險度標準分級。所有納入患兒通過前期化學治療后，骨髓完全緩解，化驗血常規(guī)、肝功能、腎功能等指標基本正常，均符合進一步化療標準。

1.2 化療方案 在給予所有納入研究患兒誘導緩解及早期強化治療后，予HD-MTX方案治療(低危組3 g/m2，中危組及高危組5 g/m2)，首先將MTX總量的1/6(≤500 mg)作為突擊量，在30 min內(nèi)快速靜脈滴注，余量于23.5 h內(nèi)泵，化療期間予水化和堿化治療，并對重要臟器進行保護治療。在突擊量MTX滴入后0.5～2 h內(nèi)，給予1次化療藥物的鞘內(nèi)注射：低危組鞘內(nèi)注射二聯(lián)藥物(甲氨蝶呤、地塞米松)，中、高危組鞘內(nèi)注射三聯(lián)藥物(甲氨蝶呤、阿糖胞苷、地塞米松)。MTX滴注開始后42 h，予亞葉酸鈣(CF)解救，劑量為每次15 mg/m2，每6 h解救1次，具體次數(shù)根據(jù)MTX血藥濃度變化動態(tài)調(diào)整，直到MTX血藥濃度<0.1 μmol/L。

1.3 MTX血藥濃度測定 在HD-MTX化學治療開始后的48 h，采集納入研究患兒的靜脈血2 ml，送至藥理實驗室，利用均相酶免疫分析法(EMIA)，用快速血藥質(zhì)量濃度測定儀檢測MTX的血藥濃度。若48 h的MTX血藥濃度≥1 μmol/L，則可稱為排泄延遲。

1.4 不良反應評價 首次HD-MTX治療后7 d對不良反應進行統(tǒng)一評價,觀察患兒是否出現(xiàn)骨髓抑制、肝腎功能損傷或其他不良反應，并按照美國衛(wèi)生及公共服務部國立衛(wèi)生研究院國家癌癥研究所的不良事件常用術(shù)語評定標準(NCI-CTCAE V5.0),對化學治療所致不良反應進行分級。若不良反應等級超過II級，則認為該化學治療發(fā)生了不良反應。

1.5 基因型測定 在HD-MTX治療前，用EDTA管采集外周靜脈血2 ml用于基因檢測。首先采用天根磁珠法血液基因組提取試劑盒提取DNA。設計特異性引物，用設計的引物進行特異性PCR擴增：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃鏈延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃補充延伸10 min。然后進行PCR產(chǎn)物鑒定：用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，與目的條帶大小一致，進行Sanger測序。最后進行測序結(jié)果分析：用Chromas軟件打開，與指定基因的特定位點進行對比得出結(jié)果。上述過程由北京智因東方醫(yī)學研究中心有限公司協(xié)助完成。

1.6 統(tǒng)計學處理 本次研究應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理研究數(shù)據(jù)，選擇卡方檢驗或Fisher′s精確概率法分析組間的差異，進而比較ABCB1不同基因型患兒經(jīng)過HD-MTX化學治療后MTX血藥濃度的差異及發(fā)生不良反應的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒一般資料 本研究共納入ALL患兒132例，其中男78例，女54例，初診時年齡為8周～16歲，中位年齡4歲，低危組患兒56例，中高危組患兒76例。野生型CC53例，雜合突變型CT25例，純合突變型TT54例。應用Hardy-Weinberg對本研究所有納入研究對象的基因型分布進行分析，提示本研究檢測的ABCB1基因各基因型頻率達到遺傳平衡(P>0.05)?；純旱囊话阗Y料見表1。

表1 患兒一般資料

2.2ABCB1基因多態(tài)性與48 h MTX血藥濃度的關(guān)系 見表2,結(jié)果顯示,突變型TT型48 h MTX血藥濃度更高，ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX化療開始后48 h的MTX血藥濃度間有相關(guān)性(P<0.05)，說明ABCB1基因多態(tài)性與ALL患兒HD-MTX化療中MTX排匯延遲有關(guān)。

表2 ABCB1 基因多態(tài)性與化療后48 h MTX血藥濃度之間的關(guān)系

2.3ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX化療不良反應的關(guān)系 本研究中共出現(xiàn)了15例HD-MTX相關(guān)的不良反應，其中白細胞減少7例，中性粒細胞減少1例，血紅蛋白降低2例，腎功能異常5例，沒有出現(xiàn)血小板減少及肝功能異常的病例。進一步分析ABCB1各基因型與HD-MTX化療不良反應之間的相關(guān)性(見表3)，結(jié)果顯示ABCB1各基因型患兒HD-MTX化療所致各項不良反應例數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX 化療不良反應的關(guān)系

在急性淋巴細胞白血病的化學治療中，不同危險度ALL的甲氨蝶呤使用劑量并不相同，低危患兒按照3 g/m2，中危及高?；純喊凑? g/m2。因此，本研究將納入患兒分成低危組和中、高危組，并分別研究兩組與HD-MTX化療毒副作用的關(guān)系。低危組中，ABCB1各基因型CMTX>1.0 μmol/L例數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),低危組以及中、高危組中，ABCB1各基因各患兒應用HD-MTX后各項不良反應例數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、表5。

表4 低危組中ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX不良反應之間的關(guān)系

表5 中、高危組中ABCB1基因多態(tài)性與HD-MTX不良反應之間的關(guān)系

3 討論

ALL是B淋巴細胞或T淋巴細胞在骨髓內(nèi)異常增生導致的惡性腫瘤性疾病，病因與發(fā)病機制尚不明確，目前認為該病與家族遺傳因素、環(huán)境因素(化學物質(zhì)輻射、電離輻射、核輻射)、染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常等有關(guān)，使骨髓內(nèi)的原始細胞異常增生，增生的細胞沒有正常的細胞功能，在骨髓中抑制骨髓正常的造血功能，并抑制正常的造血，從而出現(xiàn)貧血、出血、感染等一系列臨床癥狀[4]。ALL多起病急驟，發(fā)病迅速，因此在治療中格外注重快速有效。

臨床上兒童ALL主要借助化學治療，隨著醫(yī)療水平及診療技術(shù)的快速發(fā)展，其5年無事件生存率(Event-free survival，EFS)逐漸升高，現(xiàn)已達到90%以上[5]。MTX是臨床治療ALL的關(guān)鍵性藥物之一。

MTX的療效與藥物不良反應在臨床治療中存在個體差異。不同患者在接受相同劑量的MTX治療時，表現(xiàn)出不同的不良反應，目前認為，這種臨床差異與藥物吸收、代謝、轉(zhuǎn)運的基因序列改變有關(guān)[6]。

MTX通過ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體家族從細胞中排出,其中ABCB1在這個過程中發(fā)揮了重要作用。ABCB1基因位于人類第7號染色體長臂(7q21.1)，編碼p-糖蛋白(P-gp)。P-gp廣泛分布在與分泌、排泄相關(guān)的組織及器官中，如腸道、肝腎等，在P-gp中包含ATP結(jié)合區(qū)，當ATP與ATP結(jié)合區(qū)結(jié)合、水解時，則可產(chǎn)生能量，為MTX排出細胞的過程供能，從而減少有毒物質(zhì)對細胞的損害。

ABCB1C3435T位點的基因多態(tài)性是由于發(fā)生C/T堿基替代所導致的，該突變是同義突變，不會導致其編碼的氨基酸發(fā)生改變，但可能導致編碼的P-gp結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而影響到其功能，導致MTX排出延遲，使發(fā)生不良反應的可能性增高[7-8]。

有研究表明,ABCB1C3435T位點的突變基因T等位基因影響ABCB1基因的表達、產(chǎn)物的功能以及代謝[9]。本研究分析了132例ALL患兒ABCB1C3435T位點基因型與HD-MTX化療后產(chǎn)生的不良反應及MTX血藥濃度的關(guān)系，結(jié)果提示，ABCB1C3435T基因多態(tài)性與HD-MTX化療開始后48 h的MTX血藥濃度之間有相關(guān)性，突變型TT型48 hMTX血藥濃度更高，這與朱影[10]等得出的結(jié)論一致。Ramírez-Pacheco等[11]等對墨西哥兒童進行的研究也得到了相似結(jié)論，結(jié)果顯示，CC型患兒出現(xiàn)血漿中高MTX濃度和白細胞減少的風險較低。但是劉思婷等[12]的研究未發(fā)現(xiàn)ABCB1基因多態(tài)性與MTX排泄延遲具有相關(guān)性。王淑梅等[13]的研究也未發(fā)現(xiàn)兩者間有相關(guān)性。在本研究中，雜合突變型CT型相比于純合野生型CC型48 hMTX血藥濃度更低，考慮到本研究中雜合突變型CT型只有25例，顯著少于另外兩種基因里，樣本量少可能干擾研究結(jié)果。

另外在ALL的治療中，不同危險度分級的患者應用MTX的劑量不同，本研究進一步分析了不同危險度中ABCB1C3435T位點基因型與化療后MTX血藥濃度的關(guān)系，得到在低危組中兩者之間有相關(guān)性，而中、高危組中兩者間未見相關(guān)性。這可能由于中、高危ALL患兒應用MTX的劑量大，化療后MTX血藥濃度高，產(chǎn)生的藥物毒性大，而ABCB1C3435T位點基因多態(tài)性對藥物代謝的影響力有限，使其與MTX排出延遲的相關(guān)性小。

在有關(guān)HD-MTX化療后產(chǎn)生的不良反應如骨髓抑制、腎功能異常等方面，本研究發(fā)現(xiàn)ABCB1各基因型之間例數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Lopez-Lopez[14]等對西班牙的ALL兒童進行研究得到相似結(jié)論，認為ABCB1基因多態(tài)性與各種不良反應及血漿藥物濃度無明顯相關(guān)性。但是一項對黎巴嫩患者的研究[15]得到的結(jié)論是中性粒細胞減少與ABCB1基因多態(tài)性之間存在顯著的統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)。Gregers[16]等也認為該基因突變與MTX在兒童ALL治療中的療效和毒性之間存在相關(guān)性。Samara等[17]的研究認為肝臟損害與ABCB1基因多態(tài)性之間顯著相關(guān)。本研究中未發(fā)現(xiàn)肝功能異常病例，出現(xiàn)其他不良反應病例同樣較少，這可能導致本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果不一致。隨著治療水平的日益提高，藥物治療越來越個體化、安全化、及時化，在化學治療的同時，會給予充足的水化堿化加速MTX代謝及排出[18]，給予保肝、止吐等藥物支持治療，這可能是導致不良反應較少的原因，此外，本研究樣本量小，也可能影響研究結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究認為，ABCB1C3435T位點基因多態(tài)性與兒童ALL HD-MTX化學治療后的MTX血藥濃度之間具有相關(guān)性，而與HD-MTX化療所產(chǎn)生的各種不良反應不相關(guān)。本研究的不良反應例數(shù)較少，這可能與化療的同時應用水化堿化、保肝、止吐等輔助治療有關(guān)，此外，聯(lián)合其他化療藥物等其他因素都有可能造成干擾，可以通過擴大樣本量進一步分析其他MTX代謝相關(guān)酶的基因多態(tài)性聯(lián)合作用等因素，為臨床個體化治療提供更為可靠的依據(jù)。