簡春利，汪佳琪，張露瑤，余 瑛，廖 飛

（重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

新冠病毒（SARS CoV 2）引發(fā)的新冠肺炎疫情對人類生活和經(jīng)濟(jì)活動造成巨大沖擊。病毒感染涉及病毒從外部入侵人體靶細(xì)胞、病毒在胞內(nèi)復(fù)制、子代病毒感染更多細(xì)胞、病毒抗原誘發(fā)炎癥反應(yīng)等過程。新冠病毒感染患者潛伏期長且潛伏期患者仍有傳染性，這迫切需要早期診斷感染的試劑及阻斷病毒入侵靶細(xì)胞、抑制病毒體內(nèi)復(fù)制、阻滯體內(nèi)子代病毒感染等環(huán)節(jié)的藥物。針對病毒抗原的高親和力抗體，是用于新冠病毒感染預(yù)防、診斷及阻斷感染的關(guān)鍵蛋白藥物。所以，對冠狀病毒入侵靶細(xì)胞所需關(guān)鍵蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)掘適合用于封閉入侵靶細(xì)胞必需位點(diǎn)以阻斷感染的線性表位，及免疫檢測病毒抗原所需特異表位，是研制預(yù)防、治療及檢測所需特異抗體的關(guān)鍵。

新冠病毒入侵靶細(xì)胞依賴其刺突蛋白（spike protein）與膜受體結(jié)合及刺突蛋白敏感位點(diǎn)水解［1］；發(fā)掘新冠病毒刺突蛋白的重要線性表位，就成為研制所需抗體的關(guān)鍵。病毒蛋白的關(guān)鍵線性表位通常是溶液可及的連續(xù)肽段?？贵w是蛋白質(zhì)，識別／結(jié)合線性表位時對線性表位周圍空間位阻很敏感。蛋白線性表位的空間位阻主要來自蛋白中折疊的肽鏈，及蛋白翻譯后修飾基團(tuán)。新冠病毒在人細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，其刺突蛋白在人體細(xì)胞內(nèi)合成；人體細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白通常存在糖基化修飾［2］。病毒蛋白抗原的糖基化修飾遮蔽線性表位則抑制宿主體液免疫應(yīng)答，使病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊［3］。診斷及治療抗體所識別的刺突蛋白連續(xù)肽鏈線性表位如有糖基化修飾，則會因來自糖鏈的巨大空間位阻而使這類抗體失效［4－6］。因此，識別刺突蛋白的線性表位需排除該蛋白表面的糖基化修飾位點(diǎn)。

本文中預(yù)測新冠病毒刺突蛋白候選B細(xì)胞線性表位，同源建模刺突蛋白三維構(gòu)象篩選暴露的候選線性表位，Emini、Karplus Schulz法定量比較候選線性表位空間可及性和構(gòu)象柔韌性，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫判斷候選線性表位特異性，預(yù)測刺突蛋白糖基化修飾位點(diǎn)并結(jié)合最新實驗數(shù)據(jù)排除緊鄰修飾位點(diǎn)的B細(xì)胞線性表位。綜合比較，在新冠病毒刺突蛋白S區(qū)，發(fā)掘出以QLPP和RARS為代表的線性表位，為研制識別其刺突蛋白的抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 序列來源

從美國生物信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫（https：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）中搜索并下載新冠病毒刺突蛋白氨基酸全序列（Gene ID：43740568）。

1．2 同源建模

由于本研究完成時S蛋白冷凍電鏡晶體結(jié)構(gòu)才報 道 （https：／／doi．org／10．1101／2020．02．17．951848），但同源建模的結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)無顯著差異（RMSD≈0．889?），故仍用建模構(gòu)象分析候選線性表位的可及性。用Swiss Model在線同源建模；在molding任務(wù)欄下將新冠病毒刺突蛋白完整氨基酸序列以純文本格式導(dǎo)入到目標(biāo)序列框，點(diǎn)擊“Start Modeling”開始自動進(jìn)行S蛋白三維結(jié)構(gòu)建模［7］。運(yùn)行中，系統(tǒng)用BLASTP和HHblits自動搜索數(shù)據(jù)庫中與待建模目標(biāo)序列相似且有晶體結(jié)構(gòu)的蛋白為模板，通過SIM程序比較模板與目標(biāo)序列間相似性（最后選相似性近75%的模板建模），再對所得模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化給出預(yù)測的目標(biāo)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。建模結(jié)果通過DS（discov ery studio client v4．5．0．15071）軟件獲取拉氏圖（Ramachandran Plot）［8］，檢查所得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型中骨架及氨基酸殘基分布的合理性。用PyMOL（PyMOLmolecular graphics system 2．2．0）展示蛋白質(zhì)的三維模型并分析構(gòu)象。

1．3 在線預(yù)測候選線性表位及判斷其特異性

新冠病毒刺突蛋白氨基酸全序列，通過Kolas kar和Tongaonka方法［9］，利用氨基酸殘基的物理化學(xué)性質(zhì)（親水性、可及性、柔韌性）以及在已知線性表位中出現(xiàn)頻率，計算每段候選肽段的抗原傾向值（Ap）。具體用在線服務(wù)器（http：／／imed．med．ucm．es／Tools／index．html），以純文本格式導(dǎo)入目標(biāo)蛋白的序列后提交至服務(wù)器，自動預(yù)測其肽段中候選的線性表位，再據(jù)三維空間結(jié)構(gòu)定性篩選位于刺突蛋白同三聚體表面的肽段，用BLASTp搜索NCBI數(shù)據(jù)庫判斷候選線性表位的特異性。

1．4 可及性與剛性分析

在德泰生物（http：／／www．detaibio．com／tools／epitope prediction vr．html）在線服務(wù)器，輸入純文本格式新冠病毒刺突蛋白全氨基酸序列，開始自動預(yù)測線性表位的性質(zhì)。用Emini方法據(jù)蛋白抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性評價候選線性表位可及性［10］；用Karplus Schulz方法，基于已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)Cx的溫度效應(yīng)值測量碳鏈的柔韌性，從而預(yù)測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性（ht tps：／／doi．org／10．1007／BF01195768）。蛋白表面的高柔韌性連續(xù)肽段，易于與抗體經(jīng)誘導(dǎo)契合緊密結(jié)合［11］。

1．5 糖基化修飾位點(diǎn)分析

在線網(wǎng)站預(yù)測新冠病毒刺突蛋白N型和O型糖基化位點(diǎn) （http：／／www．cbs．dtu．dk／services／NetNGlyc），該服務(wù)器使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測蛋白中糖基化位點(diǎn)，并自動檢查Asn Xaa Ser／Thr易于糖基化的特征序列。具體是，在NetNGlyc和NetOGlyc任務(wù)欄下導(dǎo)入新冠病毒刺突蛋白氨基酸全序列的FASTA格式文件，提交后輸出預(yù)測結(jié)果。最后，結(jié)合最新文獻(xiàn)報道的糖基化信息排除大位阻候選表位。

2 結(jié)果

2．1 同源建模及質(zhì)量評價

新冠病毒刺突蛋白與非典肺炎病毒刺突蛋白（PDB ID：6ACC）序列一致性達(dá)到76．47%，后者是前者同源建模的合適模板［12］。新冠病毒刺突蛋白三維模型中，各亞基僅獲得與模板匹配的第15－1137位殘基的原子座標(biāo)（圖1；紫色、綠色、藍(lán)色分別代表3條肽鏈）。與非典病毒刺突蛋白類似，新冠病毒刺突蛋白的3個S1／S2異二聚體聚集成一個三聚體。新冠病毒刺突蛋白中，與ACE2相結(jié)合的3個C端結(jié)合域1位于傘形構(gòu)象同側(cè)且相距在3～7 nm。3個S2纏繞成束支撐傘形結(jié)構(gòu)。模型拉氏圖中綠色代表理想構(gòu)象區(qū)域。據(jù)氨基酸分布，絕大部分殘基都位于可接受區(qū)域，表明所建三維模型較合理（圖2）。

圖1 新冠病毒刺突蛋白三維模型側(cè)面視圖、俯視圖

圖2 新冠病毒刺突蛋白模型拉氏圖

2．2 候選線性表位預(yù)測

新冠病毒刺突蛋白全長1 273個氨基酸殘基，編碼區(qū)位于基因組21549－25730區(qū)，較蝙蝠類SARS冠 狀 病 毒、SARS CoV 和 MERS CoV 都更長［13］。

在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)63個候選線性表位。檢測及阻斷病毒感染所用抗體識別的線性表位，理論上應(yīng)位于病毒蛋白抗原三維構(gòu)象的表面。據(jù)此定性要求，選出14段位于刺突蛋白三聚體構(gòu)象表面的候選線性表位（表1）。其余候選表位多位于刺突蛋白三聚體的亞基接觸面，顯然不適合被本質(zhì)為蛋白質(zhì)的各種類型抗體識別。后續(xù)分析，主要考慮表1所列滿足基本要求的候選表位。

表1 新冠病毒刺突蛋白候選線性表位序列

2．3 候選線性表位空間可及性及柔韌性

位于蛋白抗原三維空間表面的連續(xù)肽段周圍也有位阻。單鏈抗體及天然單抗識別的線性表位長度相近，為5～11個殘基；納米抗體識別的線性表位較短，為4～7個殘基。據(jù)Emini法定量預(yù)測，可及性指數(shù)＞1且含4個及以上殘基的連續(xù)表位共20個，但位于新冠病毒刺突蛋白三聚體三維構(gòu)象表面的線性表位則只有4個（表2）。

根據(jù)Karplus Schulz方法預(yù)測蛋白骨架柔韌性。含4個及以上殘基且柔韌性指數(shù)＞1的線性表位共有28個，而位于新冠病毒刺突蛋白三聚體表面的線性表位則只有8個（表2）。

表2 位于三維結(jié)構(gòu)表面、可及性及柔韌性滿足要求的連續(xù)4個以上殘基新冠病毒刺突蛋白候選表位

2．4 糖基化位點(diǎn)預(yù)測

蛋白質(zhì)常見糖基化類型含糖鏈連接在天冬酰胺與谷氨酰胺的酰胺殘基的N 糖基化，以及連接在絲氨酸與蘇氨酸的羥基殘基的O 糖基化。

Asn Xaa Ser／Thr是易于發(fā)生糖基化的代表性位點(diǎn)（X是除pro氨酸以外殘基）［14］。在線預(yù)測顯示新冠病毒的刺突蛋白共有22個潛在N 糖基化修飾的候選天冬酰胺殘基（見表3）。

表3 SARS CoV 2刺突蛋白糖基化位點(diǎn)

本研究修改過程中，新冠病毒刺突蛋白中S蛋白的N 糖基化位點(diǎn)已實驗測定［6］，在線預(yù)測N 糖基化位點(diǎn)與實測一致。但實驗發(fā)現(xiàn)，隨著所得刺突蛋白的表達(dá)系統(tǒng)（昆蟲和HEK293）及表達(dá)批次不同，新冠病毒刺突蛋白糖基化水平和糖鏈種類有差別，且其刺突蛋白與ACE2的結(jié)合活性也存在差異［15］?？梢?，重組新冠病毒刺突蛋白的糖基化修飾存在多樣性和異質(zhì)性。

在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)O 糖基化候選位點(diǎn)主要是S673（評分0．589），T678（評分0．631）和S6869（評分0 577），與早期文獻(xiàn)預(yù)測結(jié)果一致［16］，但實驗證實O 糖基化主要發(fā)生在T323和S325［17］。可見，新冠病毒刺突蛋白糖基化修飾主要是N 糖基化。

2．5 綜合多種標(biāo)準(zhǔn)的篩選結(jié)果

針對病毒蛋白線性表位的特異抗體是免疫檢測病毒抗原的先決條件。針對多種病毒相同線性表位且能阻斷感染的高親和力抗體對多種病原體通用，對抗病毒治療更有意義。將候選表位逐個通過BLASTp進(jìn)行同源比對搜索相同及類似肽段，判斷候選線性表位的特異性，并避開糖基化位點(diǎn)。

據(jù)以上要求，篩選出刺突蛋白表面QLPP和RARS為代表的候選連續(xù)線性表位；這2個肽段都屬于Loop二級結(jié)構(gòu)。QLPP位于刺突蛋白第23－26位氨基酸，在三維結(jié)構(gòu)中位于S1區(qū)的N端結(jié)構(gòu)域區(qū)；RARS位于S蛋白氨基酸序列第683－686位，在三維結(jié)構(gòu)中位于S1和S2交界處（圖3）。在線預(yù)測RARS的S686可能發(fā)生O 型糖基化，但實驗未檢測到哺乳動物細(xì)胞合成的刺突蛋白在此位點(diǎn)發(fā)生糖基化修飾，故RARS仍為候選連續(xù)表位。

圖3 QLPP和RARS在新冠病毒刺突蛋白單體中的空間位置（A）及其局部精細(xì)構(gòu)象（B、C）

3 討論

至今未報道適合阻斷新冠病毒入侵靶細(xì)胞的特異抗體，也無高靈敏度檢測新冠病毒蛋白抗原所需特異抗體。特異抗體僅識別蛋白抗原的特定表位［18］。實踐中，蛋白的有效線性表位需同時有如下特征：

1）為表面凸出結(jié)構(gòu)，以降低肽鏈折疊造成的結(jié)合位阻而保障抗體親和力［19］。

2）避開三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)區(qū)，以免可及性太低。蛋白表面二級結(jié)構(gòu)可及性強(qiáng)而更適合成為識別位點(diǎn)［11］。

3）連續(xù)肽段長度適中，以適應(yīng)抗體有限的結(jié)合空腔。

4）無糖基化等蛋白質(zhì)修飾。

綜合考慮上述要求，獲得以QLPP和RARS代表的候選B細(xì)胞線性表位?？梢姡鹿诓《敬掏坏鞍妆砻婵捎玫腂細(xì)胞線性表位較少，這對其刺突蛋白的免疫檢測帶來挑戰(zhàn)，也對重組刺突蛋白用作蛋白疫苗的預(yù)防效果帶來壓力。

獲得針對所選線性表位的特異抗體，經(jīng)典技術(shù)是篩選分泌單抗的雜交瘤。但是單抗生產(chǎn)成本高、篩選單克隆成本高且耗時、難保障單抗親和力。篩選納米抗體、scFv突變體庫易獲得高親和力抗體，且所得抗體生產(chǎn)成本低。納米抗體分子小，能耐受較大空間位阻［20－21］。抗體結(jié)合冠狀病毒刺突蛋白家族中高度保守的融合肽阻斷其作用是阻斷感染的一種直接策略，此融合肽是廣譜抗冠狀病毒抗體的候選線性表位［22］。但是，此融合肽僅有小段凸出暴露且周圍位阻大，天然單抗親和力必然低。更重要的是，針對新冠病毒刺突蛋白的完整人源抗體可能面臨抗體增強(qiáng)效應(yīng)［23］，會促進(jìn)病毒感染多種細(xì)胞而加重病情。已經(jīng)證實，高親和力納米抗體能有效阻斷冠狀病毒入侵人體及動物的靶細(xì)胞［24－25］；納米抗體有望通過霧化吸入，遞送到人體肺部。納米抗體結(jié)合抗原的構(gòu)象互補(bǔ)區(qū)殘基進(jìn)行飽和突變可獲得大容量突變體集中庫［26］?；诖欧蛛x和迭代競爭結(jié)合，本實驗室建立指數(shù)富集高親和力抗體展示載體的納米抗體庫高通量篩選新策略，兩周內(nèi)就獲得抗FLAG標(biāo)簽納米抗體（待發(fā)表）。目前，正用這種展示庫篩選新策略，篩選所發(fā)掘新冠病毒刺突蛋白B細(xì)胞線性表位的高親和力納米抗體，以期用于應(yīng)急阻止感染而降低重癥死亡率。