陳和莉，陳 巧，劉 芳，戴 青，劉職瑞

（1．陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥劑科，重慶 400038；2．陸軍特色醫(yī)學(xué)中心圖書館，重慶 400042）

醫(yī)務(wù)人員是救治新型冠狀病毒（國際病毒分類委員會命名為SARS CoV 2）感染肺炎的主力軍，但醫(yī)務(wù)人員發(fā)生感染的情況不容樂觀［1］。2020年2月29日，中國 世衛(wèi)組織聯(lián)合專家考察組發(fā)布報(bào)告稱，全國476家醫(yī)療機(jī)構(gòu)共有2 000多名醫(yī)務(wù)人員感染新冠肺炎。因此，有效降低醫(yī)務(wù)人員感染性職業(yè)暴露具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在抗擊新冠疫情的醫(yī)務(wù)人員中，除了戰(zhàn)斗在最前線的臨床醫(yī)師和護(hù)士外，深度參與診療活動(dòng)的藥師特別是治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug mo nitoring，TDM）檢測人員同樣面臨著感染SARS CoV 2的風(fēng)險(xiǎn)［2］。國家衛(wèi)健委印發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》明確指出，SARS CoV 2的主要傳播途徑為呼吸道飛沫和密切接觸傳播，此外在相對封閉的環(huán)境下長時(shí)間暴露于高濃度氣溶膠也存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能。外周靜脈血是TDM最常用到的生物樣本，檢測人員雖按規(guī)定采取了一定的個(gè)人防護(hù)措施，但若與感染者的血樣直接接觸或誤吸入血樣經(jīng)渦旋或高速離心后產(chǎn)生的氣溶膠［3］將極大地增加感染風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的TDM通常采用直接測定的方式，并未對血樣進(jìn)行消毒，然而由于無癥狀感染者的存在，醫(yī)院雖對就診患者的流行病學(xué)史進(jìn)行了初步篩查，但患者的血樣仍可能含有達(dá)到傳播水平的SARS CoV 2，因此有必要在TDM檢測前對外周血進(jìn)行消毒以減少檢測人員的職業(yè)暴露。

目前研究顯示，SARS CoV 2對熱和紫外線敏感，56℃高溫和紫外消毒30 min可將其有效滅活［4－5］。但熱和紫外消毒是否影響血藥濃度測定以及檢測結(jié)果是否具有一致性尚不清楚，國內(nèi)外也無相關(guān)報(bào)道。

鑒于此，本團(tuán)隊(duì)選取了TDM常測的6種藥物（他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素、丙戊酸和霉酚酸）作為研究對象，系統(tǒng)考察了濕熱和紫外消毒對血藥濃度測定的影響，以期為疫情期間TDM檢測提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 藥品和試劑

他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素、丙戊酸和霉酚酸試劑盒 （批號分別為8R018UL M2、8S018UL M3、6R038UL M1、4W018UL M3、4G018UL M2、6R818UL M1），定標(biāo)品（批號分別為8R109UL M2、8S109UL L2、6R119UL L1、4W109UL M1、4G109UL M1、6R929UL L1），他克莫司＼西羅莫司 ＼環(huán)孢素全血復(fù)合物質(zhì)控品（批號為73101、73102、73103），霉酚酸質(zhì)控品（批號為6R696UL M1），他克莫司＼西羅莫司樣本處理液（批號：8S078UL M1），特異性環(huán)孢素樣品處理液（批號：6R708UL M1）均購自美國西門子公司；萬古霉素＼丙戊酸復(fù)合質(zhì)控品（批號為40381、40382、40383）購自美國Bio rad公司；甲醇（分析純，批號為20170101）購自重慶川東化工集團(tuán)有限公司。

1．2 儀器

Viva E全自動(dòng)生化分析儀及Syva血藥濃度檢測系統(tǒng)（美國西門子）；XW 80A渦旋混合儀（江蘇其林貝爾）；HC 2518高速離心機(jī)（安徽中科中佳）；TDZ4 WS低速離心機(jī)（湖南湘智）；HSG IIB 6電熱恒溫水浴鍋（上海儀表）；SW CJ 2FD超凈工作臺（江蘇安泰）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 樣本采集和消毒

考察的6種藥物的檢測樣本分為全血（他克莫司、西羅莫司和環(huán)孢素）和血漿（萬古霉素、丙戊酸和霉酚酸）。采集150例（每種藥物各25例）患者外周靜脈血3～4 mL，置于EDTA K2抗凝管中，其中血漿在4 000 r·min－1下離心5 min后獲得。全血／血漿樣本用EP管均分3份后進(jìn)行不同的處理，濕熱組采用56℃水浴30 min消毒，紫外組置于超凈工作臺用紫外燈（254 nm，8 W）照射30min消毒，對照組不做消毒處理。

2．2 樣本前處理

濕熱組樣本在前處理前確保已冷卻至室溫。全血處理方法：①他克莫司和西羅莫司：將全血渦旋混勻30 s，取200μL置于EP管中，依次加入200μL甲醇和50μL他克莫司／西羅莫司樣本萃取液，渦旋振蕩1 min，放置2 min使藥物與樣本萃取液充分反應(yīng)，14 000 r·min－1離心5 min后取上清進(jìn)樣；② 環(huán)孢素：將全血渦旋混勻30 s，取100 μL置于EP管中，加入300μL特異性環(huán)孢霉素樣本萃取液，渦旋振蕩1 min，放置2 min使藥物與樣本萃取液充分反應(yīng)，14 000 r·min－1離心5 min后取上清進(jìn)樣。

血漿處理方法：將各組血漿渦旋混勻后再進(jìn)樣。

鑒于EMIT法易受溫濕度影響，將實(shí)驗(yàn)室溫濕度控制在恒定范圍：室溫（23±2）℃，濕度（50±5）%；同時(shí)為保證數(shù)據(jù)的可靠性，同一種藥物的測定試劑均為同一批次試劑。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

全血樣本取6份全血定標(biāo)樣品和3水平全血質(zhì)控樣品，血漿樣本取6份標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)液和3水平血漿質(zhì)控樣本，按 “2．2樣本前處理”項(xiàng)下處理后上機(jī)測定，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本測定時(shí)隨行質(zhì)控。

2．4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0、GraphPad 6．0和Med Calc 19．1．7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本的正態(tài)性采用Kolmogorov Smirnov法檢驗(yàn)，若服從正態(tài)分布，用配對t檢驗(yàn)分析2種消毒組和對照組的差異，并用Pearson相關(guān)系數(shù)r評價(jià)相關(guān)性，當(dāng)r＜0 95時(shí)，認(rèn)為相關(guān)性不強(qiáng)［6］。一致性分析采用Bland Altman法，以2種消毒組與對照組藥物濃度的比值為縱軸、藥物濃度的均數(shù)為橫軸繪圖，95%一致性界限（limits of agreement，LOA）用x±1．96 SD表示，當(dāng)同時(shí)滿足如下3個(gè)條件時(shí)：①圖形中位于95%LOA范圍內(nèi)的點(diǎn)占到所有點(diǎn)的95%以上；②95%LOA在臨床最大允許范圍（0．85～1．15）內(nèi)；③P＞0．05［7］，認(rèn)為2種方法一致性較好。所有分析中P＜0．05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控結(jié)果

他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素、丙戊酸和霉酚酸定標(biāo)樣品的線性范圍分別為：0～30 ng·mL－1、0～36 ng·mL－1、40～500 ng·mL－1、2～50μg·mL－1、0～150μg·mL－1和0～15μg·mL－1，隨行質(zhì)控值（低、中、高3個(gè)水平）、質(zhì)控范圍和平均值見表1。結(jié)果顯示，6種藥物各濃度水平QC樣品的準(zhǔn)確度平均在92．02%～112．06%，批內(nèi)精密度在2．39%～9．53%，均符合有關(guān)生物樣品分析方法驗(yàn)證的要求。

3．2 配對t檢驗(yàn)

采用Kolmogorov Smirnov法檢驗(yàn)對照組、濕熱組、紫外組數(shù)據(jù)的正態(tài)性，3組數(shù)據(jù)P值均大于0 05，符合正態(tài)分布。2種消毒組和對照組間6種藥物濃度的配對t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示（圖1），消毒組中僅丙戊酸和霉酚酸的藥物濃度與對照組有顯著性差異（P＜0．01）。

3．3 相關(guān)性考察

Pearson相關(guān)分析顯示，2種消毒組和對照組間6種藥物濃度有顯著的相關(guān)性（r值均大于0 98，P值均小于0．001），線性回歸方程及r值結(jié)果見圖2。圖中實(shí)線和虛線分別表示回歸曲線和回歸曲線的置信區(qū)間。

表1 6種藥品的質(zhì)控結(jié)果（n＝3）

圖1 不同組藥物濃度的結(jié)果（n＝25）， P＜0．01

圖2 消毒和未消毒處理組中藥物濃度的相關(guān)性

3．4 Bland Altman一致性檢驗(yàn)

以2種消毒組與對照組藥物濃度的比值為縱軸、藥物濃度的均數(shù)為橫軸繪制Bland Altman散點(diǎn)圖，如圖3所示。Bland Altman方法結(jié)果見表2。由圖3和表2的結(jié)果顯示：①6種藥物濃度比值的均值（圖3藍(lán)色實(shí)線）在0．97～1．05；② 他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素分布在比值為1的橫軸（圖3橙色虛線）兩側(cè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)大致相當(dāng)，但濕熱組和對照組中丙戊酸和霉酚酸分別有12%（3／25）和24%（6／25）的點(diǎn)低于該橫軸，紫外組和對照組中丙戊酸和霉酚酸分別有28%（7／25）的點(diǎn)低于和12%（3／25）的點(diǎn)高于該橫軸；③ 濕熱組和對照組中霉酚酸以及紫外組和對照組中丙戊酸僅有92%（23／25）的點(diǎn)在95%LOA范圍以內(nèi)，其余各組藥物均有超過95%的點(diǎn)在95%LOA范圍以內(nèi)；④6種藥物95%LOA值均在臨床上最大允許范圍（0．8～1．2）內(nèi)；⑤ 除丙戊酸和霉酚酸外，他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素以及萬古霉素的P值均大于0．05。

基于本次Bland Altman法設(shè)定的一致性判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為2種消毒組和對照組間他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素的濃度一致性良好，而濕熱消毒會使丙戊酸和霉酚酸的檢測值顯著升高，紫外消毒會使丙戊酸的檢測值顯著升高、霉酚酸的檢測值顯著降低。

表2 Bland Altman方法結(jié)果

圖3 不同處理組的比值與均值的Bland Altman散點(diǎn)圖

4 結(jié)果與討論

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》明確指出，56℃30 min、紫外線或75%乙醇等脂溶性試劑可有效地滅活SARS CoV 2。在對生物樣本進(jìn)行消毒時(shí)，加入脂溶性試劑顯然會嚴(yán)重影響檢測結(jié)果，因此濕熱和紫外消毒可能是目前比較適合血液樣本消毒的方法。廣東省藥學(xué)會近期發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎患者血藥濃度檢測技術(shù)指引》提及，濕熱法不影響伏立康唑和萬古霉素的檢測，但未披露更詳細(xì)的數(shù)據(jù)予以證實(shí)。因此，本研究選取了TDM常見的6種藥物（他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素、丙戊酸和霉酚酸）和常用的檢測方法（EMIT法），探討濕熱和紫外消毒與不處理后EMIT法測得藥物濃度的差異和一致性。

本研究表明：在全血樣本中，2種消毒處理組和對照組間他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素的濃度無顯著性差異且一致性良好，原因可能是他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素進(jìn)入血液后分別有高達(dá)99%、94．5%、70%的藥物被紅細(xì)胞攝?。?－10］，并與免疫親和素FKBP12（他克莫司、西羅莫司）以及親環(huán)素cyclophilin A（環(huán)孢素）結(jié)合［11］，而56℃水浴和紫外照射30 min不顯著影響這些蛋白的穩(wěn)定性，因此所檢測的游離藥物濃度未發(fā)生明顯改變。

在血漿樣本中，2種消毒處理對萬古霉素的檢測無顯著影響，對丙戊酸和霉酚酸的檢測有較顯著的影響。該現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是3種藥物蛋白結(jié)合率的差異所致，萬古霉素與血漿蛋白的結(jié)合能力適中（＜50%）［12］，而丙戊酸、霉酚酸與血漿蛋白的結(jié)合能力極強(qiáng)（分別為87% ～95% 和97 5%）［13－14］。有研究發(fā)現(xiàn)，50℃加熱會使血漿蛋白發(fā)生明顯變性［15］，因此本研究使用的濕熱消毒（56℃水浴，30 min）可能對血漿蛋白結(jié)合率高的藥物影響更顯著，導(dǎo)致萬古霉素和丙戊酸或者霉酚酸受影響的程度截然不同。

在分析數(shù)據(jù)的過程中，使用了配對t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析和Bland Altman分析3種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。配對t檢驗(yàn)主要考察2組數(shù)據(jù)的集中位置是否相同，對隨機(jī)誤差不敏感；Pearson相關(guān)分析主要考察數(shù)據(jù)同步變化的方向與緊密程度，對系統(tǒng)誤差的識別能力較差；而Bland Altman分析既考慮了隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，還結(jié)合了專業(yè)意義進(jìn)行判斷，但存在高估系統(tǒng)誤差的風(fēng)險(xiǎn)［16－17］。鑒于上述3種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法性能各異，本研究在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)將其同時(shí)引入［18］，以避免對結(jié)果的誤判。

本研究尚存在一些局限性：①受時(shí)間限制，每種藥物僅納入了25個(gè)樣本，濃度的集中和離散趨勢可能不同于臨床真實(shí)大樣本，因此結(jié)果判定可能存在偏倚；② 只考察了TDM常用的EMIT法，其他免疫學(xué)檢測法以及液相或液質(zhì)聯(lián)用檢測法是否有影響仍待考察。

5 結(jié)論

本研究為醫(yī)院TDM檢測人員防控新冠病毒工作提供參考，在新冠病毒肺炎疫情尚未解除前，采用EMIT方法測定他克莫司、西羅莫司、環(huán)孢素、萬古霉素的血藥濃度時(shí)，可考慮先對血樣標(biāo)本采取濕熱或紫外消毒滅活病毒后再進(jìn)行處理、測定，以降低TDM檢測人員的職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)。鑒于56℃水浴和紫外線照射30 min可有效滅活曾對人類健康造成嚴(yán)重威脅的SARS CoV和MERS CoV［4］。研究結(jié)果同樣適用于這3種冠狀病毒“大流行”期間TDM檢測的血樣消毒。