黃子越，陳旺明，康鵬程，崔云甫，徐藝

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院膽胰外科，黑龍江 哈爾濱 150086

作為最常見的原發(fā)性膽道惡性腫瘤，膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)根據(jù)其發(fā)生部位分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌[1]。CCA發(fā)病率占所有胃腸道腫瘤的3%，且在過去的30年里，CCA的總體發(fā)病率有所上升，但確診后存活5年的病人的百分比沒有增加，仍然保持在10%[2]。目前CCA的病因仍不明確，且起病隱匿，惡性程度高，缺乏敏感性和特異性高的腫瘤標(biāo)志物用于早期診斷。最常用的腫瘤標(biāo)志物CA19-9診斷敏感性和特異性較低(敏感性62%，特異性63%)[2]，還可能受到膽汁淤積癥、細(xì)菌性膽管炎、胰腺炎以及其他惡性腫瘤的影響。根治性手術(shù)治療是目前CCA最有效的治療方法，但手術(shù)切除率低且預(yù)后差，術(shù)后5年總生存率為20%～40%[3]，且復(fù)發(fā)率高[4]。CCA化學(xué)治療與放射治療效果不明確，一線化療方案吉西他濱聯(lián)合順鉑化療方案，平均生存期也不足12個月[5]。因此，對于CCA的病理生理過程的研究成了必須克服的難題。

人類基因組計劃研究表明，在人類30億堿基對中，僅有不到2%的堿基序列參與編碼蛋白質(zhì)，其余98%的堿基序列均不參與編碼蛋白質(zhì)，甚至一度被認(rèn)為是無用序列[6]。隨著芯片和高通量測序技術(shù)的進步，人們對非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的生物學(xué)功能的研究也逐漸深入，將為其在作為新型腫瘤標(biāo)志物和潛在的分子靶向藥物作用位點提供充足的證據(jù)。ncRNA是一類由基因組轉(zhuǎn)錄卻不參與編碼蛋白質(zhì)的序列，可分為微小RNA(microRNA， miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA， circRNA)、Piwi相互作用RNA(Piwi interacting RNA， piRNA)等。

一、miRNA與CCA

作為一類由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而成的大小為19～25個核苷酸且無編碼蛋白能力的RNA分子[7]，miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平上通過堿基序列的互補配對降解mRNA或者抑制蛋白質(zhì)的翻譯，參與細(xì)胞的生長、分化、衰老、凋亡、自噬、遷移、侵襲等過程[8]。miRNA在動物生長發(fā)育及基因調(diào)控中的作用使人們對miRNA作為新的腫瘤標(biāo)志物或者分子靶點產(chǎn)生了興趣。既往研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA在多種腫瘤(肺癌、乳腺癌、膽管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等)的表達水平有不同程度的上調(diào)或者下調(diào)。Meng等[9]對CCA腫瘤組織和對應(yīng)正常組織的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction， qRT-PCR)定量檢測結(jié)果顯示miR-320、miR-200b、miR-21、miR-23a、miR-141、miR-27a和miR-34a在惡性膽管上皮細(xì)胞與正常膽管上皮細(xì)胞中的表達有顯著差異，其中miR-200b、miR-21、miR-141在CCA細(xì)胞中異常高表達，外源性沉默miR-200b和miR-21后可增加CCA細(xì)胞對吉西他濱的敏感性，沉默miR-141后會抑制CCA細(xì)胞的增殖。

1.miR-21 通過qRT-PCR定量檢測和CCA臨床病例分析，CCA中miR-21呈異常高表達，進一步的研究證明15-羥基前列腺素脫氫酶(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase， 15-PGDH)是CCA細(xì)胞中miR-21的直接靶標(biāo)，15-PGDH 是將前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)上無活性的代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶。同時，環(huán)氧合酶2(cycloxygenase2， COX2)的過表達和PGE2的積累可通過增強miR-21啟動子的活性上調(diào)miR-21的表達水平。miR-21通過抑制15-PGDH的表達導(dǎo)致PGE2積聚，增強的PGE2信號進一步刺激miR-21轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞miR-21水平，這些信號級聯(lián)形成一個前饋環(huán)路，驅(qū)動CCA的發(fā)生和腫瘤的進展[10]。因此，阻斷COX2/PGE2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)合靶向miR-21有希望成為治療CCA的有效方法。另有研究[11]證實miR-21可通過直接抑制靶基因同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog， PTEN)和14號蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶非受體(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14， PTPN14)的表達來促進細(xì)胞增殖和腫瘤生長，且miR-21的高表達與不良的臨床病理特征顯著相關(guān)，miR-21的表達水平的高低也可以預(yù)測總體生存期的長短，因此miR-21可作為CCA預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子。

2.miR-29b 有研究[12]通過qRT-PCR定量檢測，結(jié)果顯示miR-29b在CCA中呈異常下調(diào)表達，低表達的miR-29b會抑制CCA細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進一步的研究證實抗凋亡蛋白髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1， Mcl-1)的表達受到miR-29b的調(diào)控，因此可以通過上調(diào)miR-29b表達從而降低細(xì)胞Mcl-1水平達到促凋亡的效果。

3.miR-26a Zhang等[13]研究證實miR-26a在CCA腫瘤組織中異常高表達，過表達的miR-26a通過抑制糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase， GSK-3)和隨后激活β-鏈蛋白(β-catenin)促進CCA細(xì)胞的增殖和體外集落形成。Wang等[14]對66例CCA病人術(shù)前、術(shù)后和66例正常健康者血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，CCA病人術(shù)前血清中miR-26a的表達水平明顯高于正常健康者及CCA病人術(shù)后血清內(nèi)miR-26a的表達，術(shù)后接受化療的病人血清內(nèi)miR-26a的表達水平已經(jīng)接近正常健康者，而術(shù)后復(fù)發(fā)的病人血清內(nèi)miR-26a則呈明顯的上升，表明血清miR-26a有希望作為有效的生物標(biāo)志物，用于CCA的早期檢測。

4.miR-370 An等[15]研究表明與正常組織相比，CCA組織中miR-370表達下調(diào)，而白細(xì)胞介素(IL)-6表達上調(diào)，且多變量分析結(jié)果顯示miR-370與IL-6的表達水平呈負(fù)相關(guān)。Meng 等[16]通過進一步研究證實 IL-6 表達上調(diào)會通過甲基化依賴性調(diào)節(jié)導(dǎo)致miR-370的表達下調(diào)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)IL-6 的表達上調(diào)可使 let-7a 表達增加，從而降低信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3的磷酸化速度，促進腫瘤細(xì)胞的增殖并發(fā)揮抗凋亡作用[17]。

5.miR-200家族 Peng等[18]發(fā)現(xiàn)4個miR-200家族成員(miR-200a/b/c/429)在CCA腫瘤組織和細(xì)胞中呈顯著下調(diào)表達，進一步研究證實miR-200b/c通過直接靶向Rho-激酶2(Rho-kinase 2)促進腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，還通過直接靶向SUZ12來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，隨后上調(diào)miR-200b/c的表達，腫瘤細(xì)胞對氟尿嘧啶的敏感性提高。相似的研究[19]通過上調(diào)CCA細(xì)胞中 miR-29b、miR-205、miR-221的表達水平可增強腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。另有研究[20]證實miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p和miR-200c-3p對CCA的診斷能力均高于CA19-9，其中miR-200c-3p診斷能力最強，miR-200a/c-3p的水平與腫瘤進展密切相關(guān)。

6.膽汁中miRNA 膽汁是CCA生物標(biāo)志物的潛在來源，近年來膽汁中的細(xì)胞外miRNA表達差異與CCA的關(guān)系也有很多研究。有研究[21]通過106例膽道梗阻病人的膽汁標(biāo)本(58例良性膽道病人，48例CCA病人)對比，得出CCA病人膽汁中miR-30d-5p和miR-92a-3p的表達明顯上調(diào)，進一步研究表明miR-30d-5p和miR-92a-3p的靶基因可能參與Hippo、Wnt、p53、MAPK及EGFR等信號通路。受試者工作曲線分析顯示，膽汁來源的細(xì)胞外miR-30d-5p和miR-92a-3p可作為鑒別CCA的生物標(biāo)志物，其中miR-30d-5p診斷效果最好，敏感性為81.1%，特異性為60.5%。另有研究[22]表明膽汁中攜帶miR-195的細(xì)胞外囊泡能夠通過抑制CCA細(xì)胞的生長和結(jié)締組織增生程度而導(dǎo)致腫瘤縮小，延長生存時間，達到治療效果。

既往研究[7-8]顯示，miRNA可通過控制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為或靶向調(diào)控基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此繼續(xù)深入研究miRNA在CCA中的作用機制，將有助于了解CCA的病理生理機制，從而為CCA的診斷和靶向治療提供新的方向。

二、lncRNA與CCA

作為一類長度超過200 nt且無編碼蛋白能力的RNA分子[23]，lncRNA可充當(dāng)細(xì)胞信號通路的調(diào)控靶點參與多種基因的表達修飾[24]。既往研究表明lncRNA的表達失調(diào)控可通過誘導(dǎo)下游分子靶點的差異表達與蛋白結(jié)構(gòu)異常參與包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[25]。對于CCA中l(wèi)ncRNA的作用機制的研究將有助于為CCA的早期診斷提供有效的腫瘤標(biāo)志物或?qū)ふ覞撛诘姆肿影邢蛑委熚稽c。越來越多的研究證實，許多異常表達的lncRNA不同程度地影響著腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力，以及凋亡的發(fā)生和化療敏感性。

1.lncRNA CPS1-IT1 Ma等[26]研究證實在CCA組織和腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CPS1-IT1呈異常高表達，且 lncRNA CPS1-IT1表達水平與組織分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)侵犯密切相關(guān)，高表達 lncRNA CPS1-IT1病人的整體生存情況更差，因此 lncRNA CPS1-IT1的表達水平可作為CCA整體生存時間的獨立判斷因素。

2.lncRNA CCAT1 Jiang等[27]通過臨床病例發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1高表達的CCA病人組較低表達的病人組整體生存時間明顯縮短，進一步通過lncRNA CCAT1表達水平與臨床病例的多因素變量分析，CCA病人組織或血清內(nèi)lncRNA CCAT1的表達水平可用于CCA的診斷且效果優(yōu)于CA19-9(敏感性為81.8%，特異性為74.5%)。Zhang等[28]通過120例CCA組織芯片發(fā)現(xiàn)lncRNA CCAT1在腫瘤組織中表達顯著上調(diào)，且lncRNA CCAT1的表達水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，利用siRNA外源性沉默lncRNA CCAT1基因后腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制，隨后生物信息學(xué)分析和熒光素酶實驗顯示lncRNA CCAT1可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA， ceRNA)直接結(jié)合miR-152，阻斷miR-152與下游靶基因的結(jié)合，從而抑制CCA細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transtition， EMT)過程。

3.lncRNA-H19 Xu等[29]研究表明CCA病人腫瘤組織中l(wèi)ncRNA-H19高表達并通過影響EMT過程促進細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲，且lncRNA-H19表達水平與CCA的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，同時lncRNA-H19高表達者的5年生存率為0，而低表達者5年生存率為28%，并且高表達者的中位生存時間為29個月，而低表達者的中位生存時間可達42個月。也有研究[30]表明lncRNA H19和HULC可分別通過吸附let-7a/let-7b和miR-372/miR-373從而影響癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

4.lncRNA NEAT1 Zhang[31]等對33例CCA病人腫瘤組織與癌旁正常組織比較，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中l(wèi)ncRNA NEAT1異常高表達，通過轉(zhuǎn)染干擾小RNA(small interfering RNA， siRNA)外源性沉默lncRNA NEAT1后，癌細(xì)胞中E-鈣黏著蛋白含量降低，細(xì)胞黏附能力下降，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降。

5.lncRNA CBR3-AS1 研究[32]通過qRT-PCR定量檢測結(jié)果顯示癌組織中 lncRNA CBR3-AS1呈異常表達上調(diào)，且 lncRNA CBR3-AS1的表達水平與CCA的淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，且lncRNA CBR3-AS1高表達組病人整體生存時間更短，通過轉(zhuǎn)染外源性沉默lncRNA CBR3-AS1后可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

6.lncRNA PVT1 研究[33]報道lncRNA PVT1在CCA腫瘤組織中呈異常上調(diào)表達，且lncRNA PVT1表達水平與CCA病人腫瘤大小、組織分化程度和淋巴結(jié)浸潤密切相關(guān)。

7.lncRNA MALAT1 研究[34]通過qRT-PCR定量檢測結(jié)果顯示lncRNA MALAT1在CCA中呈異常表達上調(diào)，外源性沉默該基因后腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力均受到抑制，進一步的研究顯示lncRNA MALAT1是通過激活PI3K/Akt信號通路促進CCA細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和EMT進程。另有研究[35]報道lncRNA MALAT1也可通過內(nèi)源性競爭機制與miR-204結(jié)合，導(dǎo)致miR-204失去對下游靶基因CXCR4的調(diào)控，從而促進CCA細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

越來越多的研究表明lncRNA在大部分人體惡性腫瘤中異常表達，參與包括增殖、抗凋亡、侵襲、遷移、耐藥等多種腫瘤惡性生物學(xué)行為，同時展現(xiàn)出各種復(fù)雜的調(diào)控機制；且lncRNA的異常表達水平與腫瘤的臨床特征及病人預(yù)后密切相關(guān)。但現(xiàn)在的研究更多的是體內(nèi)細(xì)胞實驗，對于體外動物實驗的開展仍較少，且更深層面的lncRNA調(diào)控機制仍待探索，分子靶向藥物的作用位點仍不清晰，相信隨著研究的不斷深入，一定會逐漸揭示lncRNA的作用機制，為腫瘤的早期診斷和治療提供充足的證據(jù)。

三、circRNA與CCA

circRNA于1976年在病毒中被首次發(fā)現(xiàn)[36]，一度被認(rèn)為是剪切錯誤的結(jié)果。circRNA在生物體內(nèi)豐富表達，但進化上卻有高度保守性[37]，由于circRNA是沒有3′和5′末端的共價閉合的連續(xù)環(huán)，這種特殊的結(jié)構(gòu)使circRNA更穩(wěn)定，更能抵抗核酸外切酶的降解，因此使得circRNA具有巨大的生物學(xué)潛能。既往研究[8，37]表明circRNA主要充當(dāng)miRNA海綿，發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA作用，或調(diào)控轉(zhuǎn)錄和編碼蛋白質(zhì)。

Xu等[38]通過qRT-PCR定量檢測結(jié)果顯示circ_0001649在CCA組織中呈顯著下調(diào)表達，并分析了circ_0001649的表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性，F(xiàn)isher精確檢驗表明低表達的circ_0001649與CCA中腫瘤較大和分化程度低密切相關(guān)。轉(zhuǎn)染circ_0001649過表達載體后癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移受到明顯抑制，而外源性沉默circ_0001649后則產(chǎn)生了相反的結(jié)果，因此circ_0001649可作為一個抑癌基因成為CCA的相關(guān)治療靶點。另有研究[39]通過qRT-PCR定量檢測結(jié)果顯示circ_0005230在CCA組織和細(xì)胞內(nèi)呈上調(diào)表達狀態(tài)，circ_0005230的表達水平與臨床病理分期密切相關(guān)過表達的circ_0005230通過海綿化miR-1238和miR-1299促進CCA細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，外源性沉默該基因后，正常膽管上皮細(xì)胞的生長和凋亡無影響，而CCA腫瘤細(xì)胞的增殖能力被抑制，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，腫瘤細(xì)胞凋亡增加。還有研究[40]證實circ_000284在CCA組織內(nèi)、血漿中呈異常上調(diào)表達，進一步研究表明circ_000284通過與miR-637競爭性結(jié)合，導(dǎo)致LY6E上調(diào)，從而刺激CCA的增殖和轉(zhuǎn)移，同時外泌體介導(dǎo)的circ_000284可刺激鄰近正常細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，從而促進CCA的發(fā)生發(fā)展。Lu等[41]通過92例CCA病人的腫瘤組織和癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中circ SMARCA5的表達下調(diào)，且circ SMARCA5高表達與腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，進一步通過Cox回歸分析顯示，高表達的circ SMARCA5可延長總生存期，同時會提高腫瘤細(xì)胞對吉西他濱和順鉑的化療敏感性。還有研究[42]證實circRNA Cdr1as在CCA腫瘤組織中表達上調(diào)，circRNA Cdr1as表達水平與CCA的TNM分期和術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，此外，通過多變量分析證實circRNA Cdr1as的表達水平與CCA病人的總生存期呈負(fù)相關(guān)，因此circRNA Cdr1as可作為CCA病人預(yù)后的獨立判斷因素。Xu等[43]研究表明在CCA細(xì)胞中，circ-CCAC1通過海綿化miR-514a-5p上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子YY1(YIN-YANG 1 transcription factor)從而促進細(xì)胞進程，細(xì)胞中circ-CCAC1的上調(diào)促進了CCA細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，因此其有可能作為新的腫瘤標(biāo)志物和生物治療靶點。

目前的研究表明circRNA主要起miRNA海綿作用，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，但是對于circRNA和miRNA相互作用的詳細(xì)機制仍不清楚，同時未明確闡述circRNA與CCA存在直接關(guān)系，且目前仍缺乏足夠樣本量的動物實驗和臨床研究證實circRNA在治療中的作用，相信通過加強這方面的研究，circRNA就有可能成為新型有效的腫瘤標(biāo)志物和分子治療的靶點。

四、piRNA與CCA

作為一類主要存在與哺乳動物生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中的長度約為30 nt的小RNA分子，piRNA通過與PIWI蛋白家族成員結(jié)合形成PIWI復(fù)合物影響轉(zhuǎn)座子沉默、精子發(fā)生、基因組重排、表觀遺傳調(diào)控、蛋白質(zhì)調(diào)控和生殖干細(xì)胞維護[44]。研究表明，piRNAs可以組織特異性的方式在多種人類組織中表達，并在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號通路。此外，越來越多的研究表明，在各種癌癥中異常表達的piRNA和PIWI蛋白有可能作為腫瘤診斷和治療的新的生物標(biāo)志物和治療靶點。Gu等[45]研究顯示：與健康人相比，CCA病人血清中有694個piRNAs表達上調(diào)，36個piRNAs表達下調(diào)，對CCA病人術(shù)前、術(shù)后1周血清內(nèi)piRNA及健康體檢者血清內(nèi)piRNA檢測，發(fā)現(xiàn)CCA病人術(shù)后1周血清中piR-10506469和piR-14090389較術(shù)前顯著降低。此外，通過臨床病例和多因素變量分析，piR-20548188的表達水平與CCA病人的TNM分期密切相關(guān)。綜上所述，在CCA血漿中差異表達的多個外泌體piRNAs可能是診斷CCA潛在生物標(biāo)志物。亦有研究發(fā)現(xiàn)部分PIWI蛋白在腫瘤中特異性表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究[46]通過檢測41例肝門部膽管癌(hilar cholangiocarcinima， HCCA)組織和10例正常膽管組織中PIWIL2的表達發(fā)現(xiàn)PIWIL2在HCCA組織中呈顯著高表達，進一步臨床病理特征分析表明PIWIL2的表達水平與腫瘤大小、病理類型及淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與TNM分期及腫瘤分化程度密切相關(guān)，且生存曲線結(jié)果顯示PIWIL2高表達病人組的整體生存時間較低表達組更短。目前對于piRNA與CCA的研究較少，僅僅報道了piRNA在CCA病人血清中的表達差異，且piRNA參與CCA進程的調(diào)控機制仍不清晰，仍需進一步的探索與研究，為腫瘤的綜合治療提供充足的理論依據(jù)。

五、小結(jié)與展望

目前的研究表明，ncRNA通過影響CCA腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為或靶向調(diào)控基因從而影響CCA的發(fā)生發(fā)展。但由于ncRNA數(shù)量龐大，種類繁多，且目前對于ncRNA準(zhǔn)確的表達位點、作用方式以及靶基因的研究仍不明確，因此繼續(xù)深入研究在CCA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的ncRNA， 分析其與疾病發(fā)生之間的因果關(guān)系和作用機制，將為CCA的診斷和治療提供有效的思路。