徐永艷，蘇 明，方笑涵，劉 暢，劉芃菲，趙曉濤(北京大學人民醫(yī)院檢驗科，北京 100044)

動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的病理基礎，以動脈內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)沉積、粥樣斑塊形成為特點，其中易損斑塊容易發(fā)生破裂并誘導血栓形成，與心肌梗死、腦梗死等心腦血管事件的發(fā)病密切相關(guān)[1-3]。血管平滑肌細胞的過度凋亡與凋亡基因中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)的表達水平上升有關(guān)[4-5]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件(anti-oxidative response element，ARE)通路是在心腦血管疾病中起重要作用的抗氧化通路，其也在細胞凋亡中起調(diào)控作用[6]。淫羊藿的有效成分淫羊藿苷具有保護作用，在肝臟、腎臟中均通過激活Nrf2/ARE通路減輕不同病理因素引起的組織損傷[7-8]。本研究將在載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)-/-小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊模型中研究淫羊藿苷對細胞凋亡及Nrf2/ARE通路的調(diào)控作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 正置顯微鏡(日本Nikon公司)；凝膠電泳儀及成像儀(美國Bio-rad公司)。

1.2試藥 淫羊藿苷(美國Sigma公司)；HE檢測試劑盒、TUNEL檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2和ARE一抗均購自Abcam公司；MDA、8-OHdG和TAC檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3動物 24只SPF級ApoE-/-小鼠[雄性、18～20 g，許可證SCXK(京)2016-0011]，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1動物分組、造模及給藥 將ApoE-/-小鼠隨機分為對照組、模型組和淫羊藿苷組，每組各8只。全部小鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，做頸正中切口、分離頸總動脈，對照組不進行其他操作，模型組和淫羊藿苷組在動脈周圍植入內(nèi)徑0.3 mm的硅膠管，用6-0絲線固定，關(guān)閉切口。手術(shù)后，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)及0.5 mL生理鹽水灌胃，1日1次，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)及0.5 mL生理鹽水灌胃，1日1次，淫羊藿苷組給予高脂飼料喂養(yǎng)及100 mg·kg-1淫羊藿苷灌胃，1日1次。12周后進行取材及檢測。

2.2血管病理改變的HE檢測 取小鼠右側(cè)頸總動脈，用石蠟包埋后制做病理切片，采用HE檢測試劑盒進行染色，按照試劑盒說明書進行操作，在顯微鏡下觀察血管的病理改變。

2.3血管平滑肌細胞凋亡的TUNEL檢測 取右側(cè)頸總動脈的病理切片，采用TUNEL法試劑盒進行染色，按照試劑盒說明書進行操作，在顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算比值作為細胞凋亡率。

2.4Western blot檢測 取小鼠右側(cè)頸總動脈，加入裂解液后進行勻漿，勻漿液在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1離心10 min，分離上清進行Western blot檢測。在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)，NC在室溫下封閉。繼而經(jīng)一抗孵育(4 ℃)、二抗孵育(室溫)后在凝膠成像儀內(nèi)進行顯影，得到目的蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2、ARE及內(nèi)參蛋白β-actin的條帶，將目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為蛋白表達水平。

取右側(cè)頸總動脈勻漿后的離心上清液，采用試劑盒檢測MDA、8-OHdG和TAC的水平，按照試劑盒說明書進行操作。

3 結(jié)果

3.13組小鼠血管病理改變的比較 如圖1所示，對照組小鼠頸動脈的血管壁光滑，未出現(xiàn)粥樣斑塊；模型組小鼠頸動脈血管壁內(nèi)可見斑塊沉積，且斑塊內(nèi)脂質(zhì)較大、斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；淫羊藿苷組小鼠頸動脈血管壁內(nèi)斑塊縮小且結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

圖1 3組小鼠血管病理改變的比較(HE染色，×10)Fig.1 Comparison of vascular pathological changes among the 3 groups of mice (HE staining，×10)

3.23組小鼠血管平滑肌中細胞凋亡的比較 如圖2所示，對照組小鼠血管平滑肌細胞未見明顯凋亡，模型組和淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌細胞的凋亡率分別為14.59%±3.23%和6.51%±1.59%。與對照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

圖2 3組小鼠血管平滑肌中細胞凋亡的比較(TUNEL染色，×100)Fig.2 Comparison of apoptosis in vascular smooth muscle among the 3 groups (TUNEL staining，×100)

3.33組小鼠血管平滑肌中凋亡基因表達水平的比較 如圖3、表1所示，與對照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中Bax、Caspase-3的表達水平明顯升高，Bcl-2的表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中Bax、Caspase-3的表達水平明顯降低，Bcl-2的表達水平明顯升高(P<0.05)。

表1 3組小鼠血管平滑肌中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達水平的比較Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expression in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

圖3 3組小鼠血管平滑肌中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達水平的Western blot檢測Fig.3 Results of Western blot detection of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expression in vascular smooth muscle of the 3 groups of mice

3.43組小鼠血管平滑肌中氧化應激指標的比較 如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG的水平明顯升高，TAC的水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG的水平明顯降低，TAC的水平明顯升高(P<0.05)。

表2 3組小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG和TAC的比較Tab.2 Comparison of MDA，8-OHdG and TAC in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

3.53組小鼠血管平滑肌中Nrf2/ARE通路的比較 如圖4、表3所示，與對照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表達水平明顯升高(P<0.05)。

圖4 3組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE表達水平的Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Results of Western blot detection of Nrf2 and ARE expression in vascular smooth muscle of the 3 groups of mice

表3 3組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE表達水平的比較 Tab.3 Comparison of Nrf2 and ARE expression in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

4 討論

動脈粥樣硬化的特征是脂質(zhì)在血管壁沉積，引起巨噬細胞吞噬并泡沫化、促進血管平滑肌細胞增殖和遷移。當動脈粥樣斑塊形成后，斑塊內(nèi)脂質(zhì)及纖維帽均會發(fā)生變化，斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心增大、斑塊纖維帽變薄導致易損斑塊的形成，容易發(fā)生斑塊破裂并引起血栓形成，進而造成心肌梗死、腦梗死等急性心腦血管事件的發(fā)生。因此，易損斑塊的臨床危害大，需要積極防治。近年關(guān)于易損斑塊形成的研究認為，細胞凋亡是與斑塊穩(wěn)定性下降密切相關(guān)的生物學環(huán)節(jié)，血管平滑肌細胞的過度凋亡會造成斑塊內(nèi)形成壞死核心、引起斑塊纖維帽變薄，最終造成易損斑塊的形成[4-5]。本研究從細胞凋亡的角度分析易損斑塊的防治手段。

ApoE在脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用，敲除ApoE后給予高脂喂養(yǎng)是建立動脈粥樣硬化模型的常用方法。王南丁等[9]的實驗是在敲除ApoE及高脂喂養(yǎng)的基礎上采用PCCP建立易損斑塊模型，本研究采用與王南丁等[9]相同的方法建立易損斑塊模型，通過HE染色觀察血管病理改變可知，動脈壁內(nèi)脂質(zhì)斑塊沉積且斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心較大、斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，符合易損斑塊的特征；通過TUNEL染色證實，模型組小鼠血管平滑肌出現(xiàn)了顯著的細胞凋亡，表明血管平滑肌細胞凋亡與易損斑塊的形成有關(guān)。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等生物學作用。多項心血管疾病相關(guān)的研究證實，淫羊藿苷在心肌缺血再灌注損傷及內(nèi)皮細胞氧化應激損傷過程中起抗凋亡的作用，能夠調(diào)控Bax和Bcl-2的表達，從而抑制線粒體途徑細胞凋亡[10-12]。Bax和Bcl-2在Caspase-3表達中分別起促進和抑制作用，進而能夠分別發(fā)揮抗凋亡和促凋亡的作用[13-14]。本研究在易損斑塊模型小鼠中檢測了線粒體途徑凋亡基因的表達后發(fā)現(xiàn)，Bax、Caspase-3的表達水平明顯升高，Bcl-2的表達水平降低，表明在易損斑塊的形成過程中線粒體途徑凋亡發(fā)生了過度激活。在易損斑塊造模過程中給予淫羊藿苷灌胃干預后，小鼠血管平滑肌中的細胞凋亡率降低，促進線粒體途徑凋亡的Bax、Caspase-3的表達水平也下降，抑制線粒體途徑凋亡的Bcl-2表達水平升高，表明將淫羊藿苷用于易損斑塊的治療能夠抑制線粒體途徑細胞凋亡。

在心血管疾病的發(fā)病過程中，平滑肌細胞凋亡、內(nèi)皮細胞凋亡的調(diào)控與氧化應激有關(guān)，自由基大量生成，一方面引起細胞的氧化損傷，造成MDA、8-OHdG等氧化產(chǎn)物的生成量增多[15-16]；另一方面通過調(diào)控下游NF-κB等途徑引起細胞凋亡[17-18]。本研究對易損斑塊形成過程中氧化應激的分析顯示，MDA、8-OHdG的水平升高，TAC的水平降低；淫羊藿苷干預后，MDA、8-OHdG的水平降低，TAC的水平升高。這一結(jié)果表明氧化應激與易損斑塊的形成有關(guān)，淫羊藿苷對氧化應激具有抑制作用。Nrf2/ARE通路是重要的抗氧化通路，同時也具有抗凋亡作用[19-20]，本研究證實淫羊藿苷使易損斑塊模型小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表達量增加，提示淫羊藿苷的抗凋亡及抗氧化作用與激活Nrf2/ARE通路有關(guān)。

綜上所述，淫羊藿苷能夠改善ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化易損斑塊，這與抑制細胞凋亡及Nrf2/ARE通路有關(guān)，未來淫羊藿苷有望成為防治易損斑塊、治療心腦血管疾病的潛在藥物。