梁 媛, 黃躍雁, 郭 霞, 劉淑紅， 劉吉娜， 曹 靜

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻喉科, 河北 承德 067000)

藥物性聾是指因抗腫瘤類藥物、抗生素、水楊酸鈉等藥物應用過程中或應用后發(fā)生的感音神經(jīng)性耳聾，其中氨基糖苷類抗生素如慶大霉素、卡那霉素等是最常見的耳毒性藥物。由于慶大霉素等所導致的藥物性聾嚴重者可引起終身聽力損傷，因此，一直以來人們對慶大霉素等耳毒性病理機制的研究從未停止，目前機制闡述主要有自由基損傷學說、代謝抑制學說、鈣離子紊亂學說等，但確切機制至今仍不清楚，也無特效防治手段或藥物。Jaumamm等[1]首次描述了PDE5蛋白在耳蝸中內(nèi)毛細胞(IHC)、外毛細胞(OHC)和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SGNs)的表達及其與環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶-1(Prkg1)的部分共定位，表明在這些細胞中存在PDE5-cGMP-Prkg1信號傳導，這一研究為藥物性聾臨床防治又提供了新的路徑。伐地那非作為一種5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑，是通過改變NO/cGMP代謝途徑發(fā)揮抵制血小板凝聚、促進血管收縮等諸多作用，其已經(jīng)在性功能障礙、心血管系統(tǒng)、肺動脈、等方面取得了公認肯定的療效，但在內(nèi)耳方面尚無系統(tǒng)研究。本實驗通過建立慶大霉素致豚鼠藥物性聾動物模型，以伐地那非作為實驗藥物進行藥物性聾干預研究，探討其在慶大霉素致豚鼠耳蝸功能損傷中所發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料:實驗動物由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，選擇條件：雄性豚鼠30只；8周齡大??；健康雜色；飼養(yǎng)場所安靜，溫度控制在22℃左右，濕度控制在50%左右；耳廓反射靈敏；體重245～310g。應用數(shù)字表法將符合條件的雄性豚鼠30只分為三組，分別是空白對照組、模型對照組以及治療組，每組豚鼠各10只。三組豚鼠均采用戊巴比妥鈉(劑量：40mg/kg)進行腹腔麻醉，起效后在實驗豚鼠雙側皮層聽區(qū)硬膜外進行手術，埋植記錄電極，術畢應用牙科水泥進行固定，整個手術過程嚴格執(zhí)行無菌操作。三組豚鼠術后穩(wěn)定7d，而后開始實驗。

1.2主要試劑和儀器:實驗藥物：伐地那非，生產(chǎn)商為Bayer Pharma AG，批號為H090491；硫酸慶大霉素，生產(chǎn)商為華北制藥集團制劑有限公司，規(guī)格為80mg/支，國藥準字號H13020452；戊巴比妥鈉，生產(chǎn)商為廣州化學制劑廠，生產(chǎn)批號為20131212。實驗儀器：聽覺腦干誘發(fā)電位儀，生產(chǎn)商為丹麥丹迪公司，型號為Keyponit型4通道；掃描電子顯微鏡，生產(chǎn)商為日本日立公司，型號為S-3500N SEM。

1.3方法:第一階段(建模)：模型對照組、治療組豚鼠均給予腹腔注射硫酸慶大霉素120mg·kg-1·d-1，連續(xù)2周。第二階段(藥物實驗)：建模完成后，模型對照組豚鼠給予腹腔注射生理鹽水，劑量為4mL/kg，每日注射1次，連續(xù)注射4周。治療組豚鼠給予腹腔注射伐地那非，劑量為1.0mg/kg，用生理鹽水稀釋后注射劑量為4mL/kg，每日注射1次，連續(xù)注射4周。整個實驗過程中空白對照組不給予特殊處理。

1.4聽性腦干反應(ABR)的測量:三組雄性豚鼠限制于測試籠之中，均保持清醒狀態(tài)，放在符合國家相關標準的隔聲電屏蔽室之內(nèi)。分別在豚鼠測試耳同側乳突部位放置參考電極，在測試耳對側的乳突部位放接地電極。打開聽覺腦干誘發(fā)電位儀，濾波帶通設置為30～3000Hz，掃描時間設置為15ms，疊加設置為1024次。選用方波脈沖刺激聲(波寬0.1ms，頻率設為20Hz)，ABR閾值記錄值選擇當Ⅲ波剛出現(xiàn)時候的刺激強度。測量時間點：建模前1d、建模開始后每1周，空白對照組也在相應時間點進行測量。

1.5掃描電鏡觀察:每組豚鼠隨機選擇5只，均取左耳耳蝸，進行掃描電鏡觀察。處理過程：在最后一次ABR測試過后，將2%戊巴比妥鈉按30mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，取出聽泡，在蝸尖處鉆孔，鐙骨脫位；使用2.5%的戊二醛進行前固定；使用濃度為0.1moL/L的磷酸鹽緩沖液進行三次的漂洗，每次大約洗10min；采用濃度為1.0%的鋨酸固定60min后，再次使用磷酸鹽緩沖液進行漂洗，而后乙醇梯度脫水、干燥，最后金屬鍍膜；應用掃描電鏡，觀察、記錄實驗豚鼠螺旋器細胞超微結構的變化。

2 結 果

2.1三組豚鼠ABR閾值的變化比較:在實驗過程中，空白對照組10只豚鼠的聽覺持續(xù)保持正常，ABR閾值無明顯變化。模型對照組、治療組的豚鼠在慶大霉素注射2周以后，ABR閾值均出現(xiàn)顯著性上移，與建模前1d的ABR閾值比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這兩組豚鼠建模后的ABR閾值比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示聽覺損害建模成功。藥物實驗階段，治療組、模型對照組建模結束后給予相應藥物注射治療，在治療后的各個時間點，治療組的ABR閾值均明顯低于同期的模型對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療組從治療第1周開始，ABR閾值持續(xù)呈現(xiàn)下降，模型對照組從建模結束后的4周內(nèi)，ABR閾值仍持續(xù)性上升，并且第4周測得的ABR閾值顯著高于與第1周，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過重復測量方差分析，組間、時間在三組豚鼠ABR閾值中存在明顯的主效應(P<0.05)，組間與時間也存在明顯的交互作用,見表1。

表1 三組豚鼠不同時間點的ABR閾值聲壓級，dB)

2.2掃描電鏡觀察:空白對照組耳蝸的外毛細胞形態(tài)表現(xiàn)為排列整齊，界限清楚，提示形態(tài)正常(圖1所示)。模型對照組外毛細胞呈現(xiàn)出聽毛紊亂，或融合，或缺失，提示形態(tài)出現(xiàn)明顯的損傷(圖2所示)。治療組觀察到外毛細胞形態(tài)結構基本上正常，只有聽毛出現(xiàn)輕度的傾倒、融合現(xiàn)象，提示耳蝸損傷程度比較輕微(圖3所示)。

圖1 空白對照組—耳蝸毛細胞形態(tài)(外毛細胞×800)

2.3不良反應:此次實驗的整個過程，沒有實驗豚鼠發(fā)生死亡，也沒有實驗豚鼠發(fā)生耳內(nèi)感染、行走異常等不良癥狀，給予不同藥物注射后實驗豚鼠也沒有發(fā)生與藥物相關的不良反應。

圖2 模型對照組—耳蝸毛細胞形態(tài)(外毛細胞×800)

圖3 治療組—豚鼠耳蝸毛細胞形態(tài)(外毛細胞×800)

3 討 論

感音神經(jīng)性聾是耳科學領域中的常見病，發(fā)病率較高，且在逐年增加，其中臨床藥物是感音神經(jīng)性聾最為常見的致病因素，在這些臨床藥物中，氨基糖甙類抗生素由于使用較為廣泛，其導致的感音性耳聾更為多見。氨基糖苷類抗生素是廣譜殺菌藥，廣泛的應用于臨床治療，但是其在內(nèi)耳的內(nèi)外淋巴液內(nèi)可有高濃度蓄積，會產(chǎn)生明顯的耳毒性，從而損傷哺乳動物耳蝸的感音結構以及神經(jīng)節(jié)細胞，造成聽力損害，這是慎重使用該類藥物的主要原因[2]。盡管如此，對臨床部分疾病來說，氨基糖甙類抗生素尤其是慶大霉素卻一直是首選之藥，甚至是必選之藥。此外，多重耐藥菌不斷地出現(xiàn)，也使得氨基糖甙類抗生素重新被臨床醫(yī)生所重視。從不同視角度探索氨基糖苷類抗生素所致的耳毒性機理以及尋找預防治療藥物的努力一直沒有停止過，但均不盡人意。

目前許多研究發(fā)現(xiàn)[3]，毛細胞內(nèi)Ca2+超載與慶大霉素所致藥物性聾密切相關。當慶大霉素進入內(nèi)耳后并被毛細胞所吸收，使細胞內(nèi)Ca2+濃度異常增加，而它的過度增加可以對細胞造成許多危害，如神經(jīng)遞質釋放的抑制、離子代謝的紊亂、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成的障礙等，但細胞內(nèi)Ca2+濃度升高的最大潛在危機是Ca2+作為一種激活劑可以啟動鈣激活蛋白的活動，不可避免地導致轉錄因子的崩潰，從而引起細胞凋亡，造成不可逆性的聽力損傷。另外，有些研究的結果顯示，由慶大霉素所導致的藥物性聾后，耳蝸中一氧化氮合酶(NOS)的活性出現(xiàn)增強，而且增強幅度與聽閾升高幅度有著明顯的相關性。這一研究結果可能提示，在慶大霉素所導致的藥物性聾的病理過程中，耳蝸中的NO扮演著重要角色。很多生理學證據(jù)證實內(nèi)耳中存在NO/cGMP途徑，并且提示此途徑能夠通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度進而調(diào)控內(nèi)耳的微循環(huán)和生理功能，尤其是在聽覺傳導、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及微循環(huán)改善方面[4]。在哺乳動物的耳蝸內(nèi)，Hensen細胞之間存在著大量而豐富的縫隙連接，這些縫隙連接可讓相關信息在皮質類固醇之間進行快速地交換，從而促進離子在整個耳蝸中的循環(huán)。當慶大霉素進入細胞內(nèi)后，異常增高的ATP使得Hensen's細胞內(nèi)的Ca2+濃度過度增加，從而阻斷縫隙連接之間的耦聯(lián)，改變了耳蝸的正常功能。OHCs的低滲應激能夠增加細胞內(nèi)Ca2+和一氧化氮產(chǎn)生，同時，在OHCs的相同亞細胞區(qū)域中檢測到PDE5和Prkg1非常接近，這是OHC中存在cGMP信號傳導復合物的要求。Matsunobu等通過研究發(fā)現(xiàn)，利用NO/cGMP路徑能夠降低由ATP所引發(fā)的Hensen細胞內(nèi)Ca2+濃度[5]，從而解除或者抑制Hensen細胞間的縫隙連接通路，最終有益于維護耳蝸的正常生理功能。另一方面，ATP利用P2γ受體使得血管內(nèi)皮細胞釋放內(nèi)皮舒張因子(EDRF)，從而引起血管的擴張，而后者證明就是NO。實際上NO具有雙重功用。當NO表達水平為正常生理劑量時，其可一定程度地抑制毛細胞鈣超載，從而保護耳蝸的正常生理功能，而當NO表達水平異常升高后，其可導致了蝸中毛細胞缺失，甚至還能夠誘導、促進神經(jīng)細胞等發(fā)生凋亡。從這個角度來看，在耳蝸中可能存在著ATP/Ca2+-NO/cGMP通路并通過這個通路來調(diào)節(jié)耳蝸功能。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在實驗過程中，空白對照組10只豚鼠的聽覺持續(xù)保持正常，ABR閾值無明顯變化。另外二組雄性豚鼠在注射慶大霉素之后，ABR閾值發(fā)生普遍性的上移。在治療4周以后，模型對照組豚鼠ABR閾值仍在49分貝以上，我們認為，此組豚鼠已經(jīng)發(fā)生永久性ABR閾移。與上述相反的是，治療組10只豚鼠，ABR閾移變化相較于模型對照組有明顯減輕，特別是在治療4周后，治療組ABR閾值已經(jīng)接近藥物致聾前的閾值。本次實驗電鏡觀察結果顯示，模型對照組毛細胞損傷最為嚴重，治療組損傷程度顯著低于前者。由此可以看出，伐地那非能夠減輕慶大霉素所致的聽力損害，具有保護豚鼠耳蝸毛細胞的功用。

伐地那非屬于選擇性PDE5抑制劑，其可抑制海綿體內(nèi)PDE5，從而增強NO并調(diào)節(jié)Ca2+濃度。cGMP作用于特異性受體蛋白，包括cGMP依賴性蛋白激酶(Prkg，也稱為cGK或PKG)，表達Prkg神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞類型，包括豚鼠耳蝸支持細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(SGNs)，伐地那非通過PDE水解第二信使分子cGMP終止信號。國外研究表明，在耳蝸的毛細胞之內(nèi)，存在PDE5-Prkg1-cGMP-PARP這種信號肽[6]。PARP1屬于廣泛性表達的一種DNA缺口末端傳感器，它使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為底物催化PAR加入受體蛋白，特別是組蛋白、轉錄因子和PARP本身，從而致DNA斷裂而大量激活PARP，促進基因轉錄、復制，以及DNA堿基切除修復。與此同時，DNA的損傷、PARP1異常激活會引起NO的毒性作用，而且隨著NAD+、ATP的消耗怠盡而引發(fā)細胞死亡。在這種情況下，PDE5抑制劑不僅能夠提升cGMP信號傳導的保護作用，而且又不會引發(fā)NO的潛在破壞性，特別是因為PARP活化也可能由cGMP直接引起[7]。通過國外學者的研究顯示了PDE5抑制劑誘導的PAR濃度升高的促生存效應，這可能也反映了PARP的抗衰老能力[8]。

本實驗結果提示，在所設實驗條件之下，伐地那非可一定程度地治療豚鼠耳蝸藥物性聽功能損害，減輕耳蝸藥物性毛細胞損傷。