張宇昕，蓋聰，楊璐平，馬浩潔，張錦坤，孫紅梅，胡蝶

孤獨(dú)癥譜系障礙（ASD）是一種常見(jiàn)的兒童神經(jīng)發(fā)育障礙，其典型癥狀包括社交行為和溝通缺陷、興趣受限和重復(fù)行為等［1-2］。ASD 的病因尚不完全明確，其發(fā)病受遺傳、環(huán)境等多種因素的影響［3］。DNA甲基化作為最重要的表觀遺傳學(xué)修飾之一，對(duì)大腦的生長(zhǎng)、發(fā)育和認(rèn)知功能至關(guān)重要［4］。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）為葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，在DNA 的合成及甲基化中具有重要作用［5］。MTHFR基因多態(tài)性可通過(guò)改變DNA 甲基化和葉酸代謝降低MTHFR 酶活性，可能與ASD 等神經(jīng)障礙有關(guān)［6］。目前已有較多關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與ASD 風(fēng)險(xiǎn)之間的研究，但結(jié)論存在一定爭(zhēng)議。因此，本研究采用Meta 分析的方法對(duì)已有研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以明確MTHFRC677T 基因多態(tài)性與ASD 易感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 對(duì)中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬(wàn)方數(shù)據(jù)、PubMed、Embase、Proquest、Web of science等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行全面的文獻(xiàn)檢索。中文檢索詞為“亞甲基四氫葉酸還原酶”、“孤獨(dú)癥譜系障 礙”、“ 孤 獨(dú) 癥”、“ 自 閉 癥”；英 文 檢 索 詞 為“methylenetetrahydrofolate reductase”、“MTHFR”、“autism spectrum disorders”、“autism”、“ASD”，檢索2020 年6 月30 日之前發(fā)表的所有MTHFR基因多態(tài)性與ASD易感風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的中英文相關(guān)出版物。

1.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病例組患者符合《精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》（diagnostic and statistical manual of mental disorders，DSM）或兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表（childhood autism rating scale，CARS）診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）有關(guān)MTHFRC677T基因多態(tài)性與ASD 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)。（3）病例組和健康對(duì)照組的基因型頻率符合Hardy-Weinberg 平衡（HWE）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)、動(dòng)物研究及綜述文獻(xiàn)。（2）非病例對(duì)照研究文獻(xiàn)。

1.3 文獻(xiàn)篩選及資料提取 通過(guò)閱讀文獻(xiàn)的標(biāo)題和摘要進(jìn)行初篩，而后閱讀全文進(jìn)行二次篩查，最終根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)決定文獻(xiàn)是否納入，意見(jiàn)不同時(shí)通過(guò)討論或第3位研究者協(xié)助判斷。從每項(xiàng)確定的研究中提取出以下信息：第一作者、發(fā)表年份、國(guó)家、種族、樣本量、基因型信息和所有研究等位基因的頻率。如果文獻(xiàn)中沒(méi)有給出上述信息，則通過(guò)聯(lián)系作者獲得。

1.4 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià) 由2名研究者獨(dú)立進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)論出現(xiàn)不一致時(shí)討論協(xié)商或第3研究者協(xié)助判斷解決。計(jì)算納入文獻(xiàn)中對(duì)照組的基因型頻率是否符合HWE，若P≤0.05，代表文獻(xiàn)質(zhì)量較低；若P＞0.05，則該文獻(xiàn)質(zhì)量較高。同時(shí)使用紐卡斯?fàn)?渥太華量表（NOS）進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)，從研究對(duì)象的選擇、組間可比性和暴露因素的測(cè)量3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，共包含8個(gè)條目，共計(jì)9分，得分≥5分為高質(zhì)量研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的統(tǒng)計(jì)分析使用Stata 14.0 軟件，MTHFR多態(tài)性與ASD 之間的關(guān)系采用OR值和95%CI進(jìn)行評(píng)估。分別計(jì)算等位基因模型（Tvs.C），顯性模型（TT+CTvs.CC），純合子模型（TTvs.CC）和隱性模型（TTvs.CT+CC）的OR值及其95%CI，并進(jìn)行種族亞組分析。采用χ2檢驗(yàn)判定基因型在對(duì)照組的分布是否符合HWE。采用I2檢驗(yàn)文獻(xiàn)的異質(zhì)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，若P＞0.05 且I2≤40%，說(shuō)明異質(zhì)性小，選擇固定效應(yīng)模型；若P≤0.05 且I2＞40%，說(shuō)明各研究之間存在較高異質(zhì)性，選擇隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。通過(guò)敏感性分析來(lái)檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，為了控制潛在的發(fā)表偏倚，采用漏斗圖并通過(guò)Egger線性回歸檢驗(yàn)進(jìn)行分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入文獻(xiàn)基本特征 經(jīng)文獻(xiàn)篩選后共納入16篇文獻(xiàn)［7-22］，其中病例組2 149 例，對(duì)照組2 251 例，文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見(jiàn)圖1，納入文獻(xiàn)的基本資料見(jiàn)表1，NOS質(zhì)量評(píng)分均≥7分。

Fig.1 Pictures showed the literature screening process圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 MTHFR分析結(jié)果

2.2.1 MTHFR T 等位基因與ASD 發(fā)病之間的Meta分析 各研究結(jié)果存在異質(zhì)性（I2=85.7%，P＜0.001），采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。ASD 組和對(duì)照組攜帶T等位基因分別為1 528例、2 770例，C等位基因分別為2 770例、3 084例。以T等位基因?yàn)楸┞兑蛩?，C等位基因?yàn)榉潜┞兑蛩剡M(jìn)行分析，結(jié)果顯示，攜帶T 等位基因者發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶C 等位基因的1.51 倍（OR=1.51，95%CI：1.15～1.99，P=0.003）。種族亞組分析顯示，亞洲人攜帶T 等位基因者發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶C 等位基因人群的1.85 倍（P=0.014）；而在高加索人及非洲人組中，攜帶T等位基因者發(fā)生ASD的風(fēng)險(xiǎn)與攜帶C等位基因無(wú)關(guān)（高加索人OR=1.20，P=0.102；非洲人OR=2.17，P=0.354），見(jiàn)圖2。

Tab.1 Basic features of MTHFR C677T included in the study表1 MTHFR C677T納入研究的基本特征

Fig.2 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(T vs.C)and ASD圖2 MTHFR基因C677T多態(tài)性（T vs.C）與ASD發(fā)病的Meta 分析森林圖

2.2.2 顯性模型TT+CTvs.CC與ASD發(fā)病的Meta分析 各研究結(jié)果存在異質(zhì)性（I2=80.8%，P＜0.001），采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。ASD 組和對(duì)照組TT+CT 基因型分別為1 248 例、1 149 例，CC 基因型分別為901例、1 102例。以TT+CT 基因型為暴露因素，CC基因型為非暴露因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，攜帶TT+CT 基因型人群發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶CC基因型的1.67倍（P=0.002）。種族亞組分析顯示，高加索人攜帶TT+CT 基因型人群發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶CC 基因型的1.30 倍（P=0.024）；亞洲人攜帶TT+CT 基因型人群發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶CC 基因型人群的1.99 倍（P=0.010）；而在非洲人組中，攜帶TT+CT 基因型人群發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)與攜帶CC 基因型無(wú)關(guān)（OR=2.51，P=0.324），見(jiàn)圖3。

Fig.3 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(TT+CT vs. CC)and ASD圖3 MTHFR基因C677T多態(tài)性（TT+CT vs. CC）與ASD的Meta分析森林圖

Fig.4 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(TT vs. CT+CC)and ASD圖4 MTHFR基因C677T多態(tài)性（TT vs. CT+CC）與ASD Meta分析森林圖

2.2.3 隱性模型TTvs.CT+CC與ASD發(fā)病的Meta分析 見(jiàn)圖4。各研究結(jié)果存在異質(zhì)性（I2=61.7%，P＜0.001），因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。ASD組、對(duì)照組TT基因型分別為280例、269例，ASD組、對(duì)照組CT+CC 基因型分別為1 869 例、1 982 例。以TT基因型為暴露因素，CT+CC基因型為非暴露因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，攜帶TT 基因型人群發(fā)生ASD的風(fēng)險(xiǎn)與攜帶CT+CC基因型無(wú)關(guān)（OR=1.20，P=0.340）。在種族亞組分析中，3組Meta分析結(jié)果均顯示攜帶TT 基因型人群發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)與攜帶CT+CC 基因型無(wú)關(guān)（高加索人：OR=1.19，P=0.376；亞洲人：OR=1.46，P=0.309；非洲人：OR=1.69，P=0.618）。

2.2.4 純合子模型TTvs.CC 與ASD 發(fā)病的Meta 分析 各研究結(jié)果存在異質(zhì)性（I2=67.5%，P＜0.001），采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。ASD 組、對(duì)照組TT 基因型分別為280 例、269 例，ASD 組、對(duì)照組CC基因型分別為901例、1 102例。以TT基因型為暴露因素，CC基因型為非暴露因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，攜帶TT基因型人群發(fā)生ASD的風(fēng)險(xiǎn)與攜帶CC基因型人群差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.43，P=0.113）。種族亞組分析均顯示攜帶TT 基因型人群發(fā)生ASD 的風(fēng)險(xiǎn)與攜帶CC基因型人群差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（高加索人：OR=1.36，P=0.205；亞洲人：OR=1.72，P=0.165；非洲人：OR=2.47，P=0.490），見(jiàn)圖5。

2.3 敏感性分析 通過(guò)逐一排除研究的方法進(jìn)行敏感性分析，Meta 分析結(jié)果顯示各效應(yīng)量無(wú)明顯改變，證明結(jié)果具有穩(wěn)定性，見(jiàn)圖6。

2.4 發(fā)表偏倚 通過(guò)漏斗圖和Egger線性回歸法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，各基因型漏斗圖可觀察到各獨(dú)立研究OR在坐標(biāo)軸上圍繞漏斗圖的中心線散開(kāi)，各基因型Egger檢驗(yàn)結(jié)果均P＞0.05（Tvs.C，t=2.040，P=0.061；TT+CTvs.CC：t=1.923，P=0.076；TTvs.CT+CC，t=1.711，P=0.109；TTvs.CC，t=1.730，P=0.106），提示本研究無(wú)明顯發(fā)表偏倚。見(jiàn)圖7。

Fig.5 The Meta analysis forest map between MTHFR gene C677T polymorphism(TT vs. CC)and ASD圖5 MTHFR基因C677T多態(tài)性（TT vs. CC）與ASD的Meta分析森林圖

Fig.6 The impact of sensitivity analysis studies in Meta-analysis on the combined results圖6 Meta分析中的敏感性分析調(diào)查研究對(duì)合并結(jié)果的影響

Fig.7 Funnel plot for publication bias test in the four genetic models圖7 各遺傳模型的發(fā)表偏倚漏斗圖

3 討論

葉酸主要參與甲基化循環(huán)以及DNA 和RNA 的生物合成，葉酸代謝障礙可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激易感性，增加ASD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［23］。MTHFR是單碳代謝過(guò)程中葉酸和同型半胱氨酸代謝的關(guān)鍵酶。它將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，并參與DNA 甲基化相關(guān)的葉酸和同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)化［24-25］。遺傳因素與ASD 的發(fā)生密切相關(guān)，人類MTHFR基 因 定 位 于 染 色 體1p36.3［26］，經(jīng) 鑒 定MTHFR基因有14 個(gè)與酶缺陷相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，其中C677T基因位點(diǎn)是研究最多、在臨床上最重要的變異之一。C677T的變化是由于胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，導(dǎo)致在密碼子222 位點(diǎn)的纈氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸［27］，顯著降低MTHFR酶的活性和血漿同型半胱氨酸的濃度，導(dǎo)致神經(jīng)和血管功能障礙，繼而影響大腦功能［28］，而這種改變可能會(huì)增加ASD 的易感性。

近年來(lái)關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與ASD 易感性的研究較多，但結(jié)論尚不完全統(tǒng)一，因此筆者收集了相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析。本研究共納入了16 篇文獻(xiàn)，其中6篇表明MTHFRC677T多態(tài)性與ASD發(fā)生無(wú)關(guān)［9，10，14，16，18，20］，而其他文獻(xiàn)表明MTHFRC677T 多態(tài)性增加了ASD的易感性［7-8，11-13，15，17，19，21-22］。本研究從等位基因模型（Tvs.C）、顯性模型［（TT + CT）vs.CC］、純合子模型（TTvs.CC）和隱性模型［TTvs.（CT+CC）］進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示在等位基因模型和顯性模型中MTHFRC677T 多態(tài)性與ASD 發(fā)生具有相關(guān)性。種族亞組分析顯示，高加索人僅在顯性模型中MTHFRC677T多態(tài)性與ASD發(fā)生密切相關(guān)，而亞洲人在等位基因模型和顯性模型中均具有相關(guān)性。Sadeghiyeh 等［29］通 過(guò)Meta 分 析 也 得 出MTHFRC677T多態(tài)性可能會(huì)增加ASD易感性的結(jié)論。本研究相比于既往的Meta分析，進(jìn)行了數(shù)據(jù)更新以完善統(tǒng)計(jì)的精確度，且排除了對(duì)照組及病例組各基因型分布頻率不符合HWE 的研究，使結(jié)論更具有說(shuō)服力。此外，本研究還納入了有關(guān)非洲人種的相關(guān)文獻(xiàn)，并進(jìn)行了敏感性分析及發(fā)表偏倚檢測(cè)，其結(jié)果也提示分析的結(jié)論是較可靠的。

然而本研究還存在不足之處：（1）文獻(xiàn)合并分析后異質(zhì)性較大，進(jìn)行種族亞組分析后不能明顯降低其異質(zhì)性。Park 等［16］發(fā)現(xiàn)男性患病率大于女性，提示異質(zhì)性來(lái)源可能與性別有關(guān)，但大部分研究未報(bào)道不同性別各基因型的詳細(xì)數(shù)據(jù)，無(wú)法進(jìn)行性別亞組分析。（2）納入的部分研究樣本量偏小。

綜上所述，MTHFRC677T多態(tài)性與ASD易感性具有一定相關(guān)性，高加索人僅在顯性遺傳基因型中MTHFRC677T多態(tài)性與ASD發(fā)生密切相關(guān)，而亞洲人在等位基因模型和顯性模型中均具有相關(guān)性。