李修陽(yáng)，李曉霞，張 寧，任 健

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是臨床上常見(jiàn)的一種病因復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多樣的內(nèi)分泌-代謝紊亂性綜合征，其以生殖功能障礙(如月經(jīng)紊亂、卵巢多囊樣增大、雄激素異常等)和糖代謝異常(血糖異常、胰島素抵抗等)為特征，在育齡女性的患病率為5%～10%[1]，是婦科疾病中的一種疑難性疾病。目前，西醫(yī)主要是以激素類藥物維持月經(jīng)、促進(jìn)排卵、改善內(nèi)分泌紊亂等，多數(shù)患者因長(zhǎng)期用藥，逐漸引發(fā)肥胖、卵巢過(guò)度刺激綜合征、多胎妊娠、流產(chǎn)率增高等一系列不良反應(yīng)。中醫(yī)療法尤其是針刺療法對(duì)預(yù)防和調(diào)治PCOS具有良好的療效，但其對(duì)PCOS患者干預(yù)作用的分子機(jī)制和生物途徑尚不清楚[2]。本研究旨在通過(guò)觀察針刺聯(lián)合西藥對(duì)PCOS痰濕證患者內(nèi)分泌激素及血清小分子代謝物代謝通路的影響，明確其調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能的作用，發(fā)現(xiàn)針刺干預(yù)不同于藥物的作用靶點(diǎn)，為針刺治療PCOS提供足夠的、具有說(shuō)服力的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)與歐洲人類生殖協(xié)會(huì)共同認(rèn)定的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)[3]：①偶發(fā)排卵和/或無(wú)排卵。②臨床和/或生化指標(biāo)提示存在高雄激素血癥，并排除先天性腎上腺增生、分泌雄激素腫瘤和庫(kù)欣綜合征等可能致病的因素。高雄激素血癥的臨床表現(xiàn)包括痤瘡、多毛、禿頂，生化指標(biāo)方面強(qiáng)調(diào)了游離睪酮的臨床意義。③雙側(cè)卵巢多囊性改變：雙側(cè)卵巢有≥12個(gè)直徑在2～9 mm的小卵泡，和/或單側(cè)卵巢體積增大>10 cm3。以上3項(xiàng)具備任意2項(xiàng)或3項(xiàng)診斷為PCOS。

1.1.2痰濕證診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[4]及《中醫(yī)婦科學(xué)》[5]中痰濕證臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)擬定：①月經(jīng)周期延后，經(jīng)量少，經(jīng)色淡紅，質(zhì)黏膩如痰，或逐漸閉經(jīng)，或婚久不孕；②胸腹痞滿；③易惡心嘔吐；④形體肥胖或四肢倦怠，神疲乏力；⑤白帶多而黏膩；⑥舌淡胖或有齒印，苔膩；⑦脈滑。以上①必須具備，兼見(jiàn)其余各項(xiàng)中的3項(xiàng)即可診斷為痰濕證。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；年齡20～40歲。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)分泌功能不正常者(如甲狀腺功能減退/亢進(jìn)、糖尿病、垂體腫瘤等)；合并心腦、肝膽等其他慢性消耗性疾病，不宜針刺者；患有精神系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等疾病者；生殖系統(tǒng)或器官有器質(zhì)性病變者；近3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用影響生殖內(nèi)分泌及代謝的激素類(如孕酮類、糖皮質(zhì)激素類)藥物者；妊娠期、哺乳期女性；配合性差者。

1.4一般資料 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，納入2018年5—11月于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心門診就診的PCOS痰濕證患者40例，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：西藥組20例，年齡(28.1±2.6)歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(29.03±3.00)kg/m2。針?biāo)幝?lián)合組20例，年齡(28.2±3.8)歲，BMI(29.13±2.52)kg/m2。2組年齡、BMI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究符合《赫爾辛基宣言》倫理學(xué)要求。

1.5治療方案 西藥組：采用炔雌醇環(huán)丙孕酮片(達(dá)英-35，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20140114，規(guī)格：2 mg∶0.035 mg/片)治療，從月經(jīng)來(lái)潮或撤退性出血第5天開始連服21 d，每日1片，共治療3個(gè)月經(jīng)周期。針?biāo)幝?lián)合組：炔雌醇環(huán)丙孕酮片用法同西藥組，同時(shí)于每個(gè)月經(jīng)周期的第5天開始給予針刺治療，針刺選穴：氣海、關(guān)元、中極、子宮、陰陵泉、豐隆、太溪、太沖、肝俞、脾俞、腎俞，除氣海、關(guān)元、中極單取外，余穴均取雙側(cè)。選擇0.35 mm×50 mm無(wú)菌針灸針(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB2024-1994)，75%乙醇常規(guī)消毒后針刺諸穴，得氣后調(diào)至以患者感到舒適為度，留針30 min，期間行針2次，每日1次，每周5次，周末和經(jīng)期休息，共治療3個(gè)月經(jīng)周期。若治療期間受孕，可提前結(jié)束治療，病情較重者可適當(dāng)延長(zhǎng)治療周期。

1.6觀察指標(biāo)與方法 記錄2組治療前后BMI；檢測(cè)2組治療前后血清基礎(chǔ)內(nèi)分泌激素[促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)]水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)；應(yīng)用核磁共振氫譜(1H-NMR)檢測(cè)技術(shù)處理2組治療后血清樣本，篩選出血清中的代謝物及其參與的代謝通路。

1.6.1內(nèi)分泌激素檢測(cè)方法 2組患者分別于治療前后在早卵泡期(月經(jīng)第2～4天)或閉經(jīng)期(B超下卵泡直徑2～10 mm)采血，采血前禁食8～12h，空腹抽取靜脈血，在常溫下靜置10～20min，2 000～3 000 r/min的速度離心20 min后分離出血清，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)FSH、LH、E2、T、FPG、FINS水平。

1.6.21H-NMR檢測(cè)方法 NMR檢測(cè)用Varian 600 MHz譜儀，1H共振頻率設(shè)為599.93 MHz。橫向弛豫加權(quán)實(shí)驗(yàn)用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列，弛豫延遲為2.0 s，采集時(shí)間為1.5 s，譜寬為12 000.0 Hz，溫度設(shè)置為25 ℃，總回波時(shí)間為100 ms，累加次數(shù)64次。首先將波譜儀輸出的所有1H-NMR譜圖進(jìn)行預(yù)處理，將整理好的數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列的多元變量模式識(shí)別分析，使用SIMCA軟件進(jìn)行UV格式化處理，然后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)主要采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)。PCA是將一組觀測(cè)的可能相關(guān)變量，通過(guò)正交變換轉(zhuǎn)換為線性不相關(guān)變量(即主成分)的統(tǒng)計(jì)方法，是一種可以在低維空間內(nèi)利用少量主成分?jǐn)?shù)量來(lái)更好地解釋數(shù)據(jù)變量的分析方法，可有效評(píng)估樣本的整體水平。OPLS-DA是通過(guò)七倍交叉驗(yàn)證、置換檢驗(yàn)等對(duì)模型的有效性做進(jìn)一步檢驗(yàn)，可以排除非實(shí)驗(yàn)因素的影響，篩選出與疾病關(guān)系最密切的差異代謝物[6]。借助京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)[7](最常用的代謝網(wǎng)絡(luò)通路數(shù)據(jù)庫(kù))，通過(guò)KEGG注釋分析，找出全部差異代謝物所參與的代謝通路，綜合分析(包含富集、拓?fù)浞治?差異性代謝物所在的通路，篩選出與差異代謝物關(guān)系最密切的作用通路。

2 結(jié) 果

2.12組治療前后BMI及血清內(nèi)分泌激素、HOMA-IR比較 治療前2組患者BMI、FSH、LH、E2、T、HOMA-IR比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。治療后2組患者FSH、E2水平組間及組內(nèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；2組患者治療后BMI、LH、T、HOMA-IR均明顯低于治療前(P均<0.05)，且針?biāo)幝?lián)合組BMI、LH、T、HOMA-IR均明顯低于西藥組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.22組治療后血清1H-NMR檢測(cè)結(jié)果 2組PCA得分散點(diǎn)圖提示樣本基本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)，見(jiàn)圖1；OPLS-DA分散點(diǎn)圖及排列檢驗(yàn)圖見(jiàn)圖2及圖3(R2X=35%。 R2X的值是對(duì)模型中所有X的變量解釋率，可解釋變量R2=70.4%，可預(yù)測(cè)性Q2=2.42%。OPLS-DA是有監(jiān)督的模型,是人為地將樣本分組，看組間是否存在差異，置換檢驗(yàn)是對(duì)OPLS-DA模型的進(jìn)一步驗(yàn)證，圖中原模型的Q2和R2值均大于置換后的值，提示展示組間差異的置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ头€(wěn)定且不存在過(guò)擬合現(xiàn)象)。2組治療后血清差異代謝產(chǎn)物OPLS-DA模型載荷圖見(jiàn)圖4(圖中標(biāo)記物質(zhì)均為通過(guò)相關(guān)系數(shù)臨界值檢驗(yàn)的差異代謝物)，針?biāo)幝?lián)合組患者治療后血清中異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酸等氨基酸，3-羥基丁酸酯、甘油等脂類，α-葡萄糖、β-葡萄糖等糖類物質(zhì)均明顯多于西藥組(P均<0.05)，西藥組中二甲胺明顯增多(P均<0.05)。2組治療后差異代謝通路分析氣泡圖見(jiàn)圖5，顯示有氨?；?tRNA生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、糖酵解或糖異生、磷酸戊糖途徑等糖代謝通路差異；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等氨基酸合成與代謝通路差異；酮體的合成和降解、甘油脂代謝等脂質(zhì)代謝通路差異；其中氨?；?tRNA生物合成的富集程度最顯著，是較為明顯的差異代謝通路。

表1 2組多囊卵巢綜合征痰濕證患者治療前后BMI及血清內(nèi)分泌激素、HOMA-IR比較

圖1 西藥組和針?biāo)幝?lián)合組多囊卵巢綜合征痰濕證患者治療后血清PCA得分散點(diǎn)圖

3 討 論

古代醫(yī)家根據(jù)PCOS臨床癥狀，將其歸入“閉經(jīng)”“不孕病”等婦科疾病的范圍中，并認(rèn)識(shí)到本病的發(fā)生與痰濕有關(guān)，痰濕是引起PCOS的主要因素。

t[1]P表示第一主成分的預(yù)測(cè)得分；t[1]O表示正交主成分得分圖2 西藥組和針?biāo)幝?lián)合組多囊卵巢綜合征痰濕證患者治療后血清OPLS-DA分散點(diǎn)圖

虛線表示R2(可解釋變量)和Q2(可預(yù)測(cè)性)的回歸線圖3 西藥組和針?biāo)幝?lián)合組多囊卵巢綜合征痰濕證患者治療后血清OPLS-DA排列檢驗(yàn)圖

醫(yī)家許叔微最早提出了“濕痰、痰飲成癖囊”之說(shuō)，并總結(jié)出了“燥脾以勝濕”的診療經(jīng)驗(yàn)。元代醫(yī)家朱震亨在《丹溪心法》中指出,女性先天素體濕盛，后天又恣食肥甘，定會(huì)使經(jīng)血不暢，甚至難以攝精受孕。《萬(wàn)氏婦人科》也有類似記錄，認(rèn)為女性“肥碩，膏脂充滿”，使“元戶之門”無(wú)法打開，挾痰停滯，使氣血運(yùn)行受阻，血海蓄溢失常，而致月經(jīng)不調(diào)，影響受孕。歷代醫(yī)家很早就認(rèn)識(shí)到痰濕會(huì)引發(fā)女性肥胖、月經(jīng)不調(diào)、不孕等臨床表現(xiàn)，這些臨床表現(xiàn)吻合現(xiàn)代PCOS的癥狀，這為PCOS痰濕致病理論提供了很多依據(jù)。

針刺治療女性疾病已有悠久的歷史，其通過(guò)調(diào)節(jié)經(jīng)絡(luò)、氣血、陰陽(yáng)等發(fā)揮作用。近些年，愈來(lái)愈多醫(yī)家采用針?biāo)幒嫌弥委烶COS以及其導(dǎo)致的不孕癥，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合應(yīng)用具有取長(zhǎng)補(bǔ)短之功。鄭淑珍等[8]對(duì)國(guó)內(nèi)針刺治療PCOS進(jìn)行臨床療效、安全性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)針刺組與西藥組的治療效果相似，但在降低LH、T、LH/FSH水平及BMI方面針刺組明顯優(yōu)于西藥組，對(duì)改善卵巢功能、提高卵子質(zhì)量等也有明顯優(yōu)勢(shì)，且安全。許娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，針刺聯(lián)合西藥(達(dá)英-35)治療PCOS 2個(gè)月經(jīng)周期，其效果明顯優(yōu)于西藥治療，可有效降低LH、T水平，并可提高患者排卵率。陳鵬典等[10]也做了近幾年針?biāo)幗Y(jié)合治療PCOS的相關(guān)綜述，發(fā)現(xiàn)針?biāo)幗Y(jié)合治療已成一種治療趨向，二者結(jié)合改善子宮內(nèi)膜容受性、排卵障礙的效果均優(yōu)于單用藥物治療，安全性也明顯提高。

標(biāo)記物質(zhì)均為通過(guò)相關(guān)系數(shù)臨界值檢驗(yàn)的差異代謝物；顏色的深淺表示相關(guān)系數(shù)的大小，紅色表示強(qiáng)相關(guān)，藍(lán)色表示弱相關(guān)圖4 西藥組和針?biāo)幝?lián)合組多囊卵巢綜合征痰濕證患者治療后血清OPLS-DA模型載荷圖

氣泡表示不同代謝通路；橫坐標(biāo)表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃?，氣泡越大影響因子越大；縱坐標(biāo)表示富集分析的P值，顏色越深P值越小，富集程度越明顯圖5 西藥組和針?biāo)幝?lián)合組多囊卵巢綜合征痰濕證患者治療后差異代謝通路氣泡圖

PCOS痰濕證與腎、肝、脾三臟功能關(guān)系密切，任脈為“陰脈之?！薄爸靼ァ保梳槾讨委煷俗C大多從任脈、腎經(jīng)、肝經(jīng)、脾經(jīng)選取穴位。關(guān)元為小腸募穴，其深部即為胞宮所在,可補(bǔ)先天之元?dú)?、溫腎暖宮、調(diào)理任脈；中極為膀胱募穴，是腎經(jīng)、肝經(jīng)、脾經(jīng)與沖任脈交會(huì)穴，“應(yīng)胞宮精室”，調(diào)理沖任、利散水濕；氣海為先天元?dú)馑壑?；三穴合用，可增?qiáng)培補(bǔ)元?dú)庵В胰ň幽毾?，又可起到局部治療作用，更利于調(diào)和氣血，疏利下焦氣機(jī)。子宮穴屬于外經(jīng)奇穴，局部取穴可調(diào)節(jié)子宮血?dú)膺\(yùn)行，利于調(diào)節(jié)月經(jīng)、改善卵巢功能等。腎俞為腎之背俞穴，為補(bǔ)腎要穴，可補(bǔ)益腎精；太溪穴為腎之原穴，與腎俞穴合用，可滋腎陰、益腎陽(yáng)。PCOS痰濕證患者體內(nèi)水濕過(guò)盛，脾惡濕，濕必犯脾，故取脾之合穴陰陵泉，脾之背俞穴脾俞，以清利濕熱、健脾理氣；胃之絡(luò)穴豐隆，為祛痰要穴，可健脾祛痰，疏通氣血阻滯，諸穴配伍，增強(qiáng)健脾祛濕化痰的作用。女子“以肝為本”，且肝腎同源，取肝之原穴太沖穴，肝之背俞穴肝俞，利于疏肝理氣、清肝瀉火。三陰交為脾經(jīng)穴位，是足三陰經(jīng)的交會(huì)穴，可疏通氣血、健脾益胃、補(bǔ)腎調(diào)肝。諸穴同用，共奏補(bǔ)腎健脾、利濕化痰、調(diào)理沖任之功。本研究結(jié)果顯示，西藥和針刺聯(lián)合西藥均對(duì)FSH、E2影響不明顯，而對(duì)BMI、LH、T、HOMA-IR影響顯著，且針刺聯(lián)合西藥組治療對(duì)上述指標(biāo)的改善作用明顯優(yōu)于單純西藥組，進(jìn)一步證實(shí)針刺治療在調(diào)節(jié)PCOS患者內(nèi)分泌水平方面具有較大優(yōu)勢(shì)。

生物體中代謝組產(chǎn)生系統(tǒng)性的變化，需要體內(nèi)復(fù)雜代謝反應(yīng)與不同基因及蛋白質(zhì)共同構(gòu)成的復(fù)雜通路和網(wǎng)絡(luò)之間相互調(diào)控、作用，通過(guò)分析這些代謝通路，可以更加全面系統(tǒng)地明白疾病的病因病機(jī)、藥物作用機(jī)制等生物學(xué)問(wèn)題。本研究結(jié)果顯示，2組治療后存在多條代謝通路差異，其中針?biāo)幝?lián)合組氨?；?tRNA生物合成的富集程度最為顯著。氨?；?tRNA在蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用。蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體細(xì)胞、組織的重要有機(jī)物質(zhì)，如神經(jīng)遞質(zhì)、抗體、受體、酶等生理活性物質(zhì)均離不開蛋白質(zhì)，其承擔(dān)著整個(gè)生命活動(dòng)。氨基酸是合成蛋白質(zhì)的特有原料，其量不足與胰島素抵抗關(guān)系密切，異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸與胰島素抵抗明顯呈負(fù)相關(guān)[11]。針?biāo)幝?lián)合治療后，差異代謝物中的氨基酸種類、數(shù)量明顯增加，這可能是糾正胰島素抵抗的重要因素。結(jié)合2組治療后的差異代謝物及代謝通路發(fā)現(xiàn)，針刺干預(yù)可能是整體調(diào)節(jié)糖、脂、氨基酸代謝功能，通過(guò)TCA循環(huán)、糖酵解或糖異生、磷酸戊糖途徑等代謝通路為合成氨基酸提供相應(yīng)的碳架，增強(qiáng)纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成等通路生成新的氨基酸，也為進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)提供基礎(chǔ)。生成的氨基酸經(jīng)過(guò)活化脫水縮合形成多肽鏈，再結(jié)合特定的t-RNA,在氨?；?tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)的催化作用下，生成不同類型的氨?；?tRNA。aaRS可準(zhǔn)確識(shí)別特定的氨基酸和tRNA并結(jié)合二者，使形成的氨酰基-tRNA順利將氨基酸運(yùn)送至核糖體，再經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的翻譯、加工等過(guò)程，參與蛋白質(zhì)的合成。aaRS只作用一種氨基酸，具有校正、更正的活性，可水解其錯(cuò)誤活化的氨基酸，換上相應(yīng)的氨基酸，具有高度特異的識(shí)別功能。PCOS機(jī)體處于慢性缺氧狀態(tài)而導(dǎo)致能量代謝抑制，這可能與aaRS有密切關(guān)系。有研究報(bào)道，線粒體aaRS病變可引起線粒體疾病表型異常[12]，線粒體功能障礙是PCOS發(fā)生胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制[13]。糖的有氧氧化分解需在線粒體中進(jìn)行，若線粒體aaRS功能障礙，會(huì)限制體內(nèi)代謝通路的正常運(yùn)行，會(huì)抑制機(jī)體的正常能量代謝，進(jìn)而引發(fā)疾病。PCOS痰濕證的臨床癥狀可能與此有關(guān)，故推測(cè)線粒體aaRS很可能是針刺干預(yù)的作用靶點(diǎn)，針刺可能對(duì)其有修復(fù)作用，并能夠調(diào)節(jié)其活性，進(jìn)而整體調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝，改善PCOS痰濕證患者的內(nèi)分泌紊亂和排卵障礙，最終提高妊娠率。

總之，本研究證實(shí)針刺聯(lián)合西藥對(duì)PCOS痰濕證患者體內(nèi)代謝有明顯干預(yù)作用，其可能通過(guò)影響氨?；?tRNA生物合成，以修復(fù)并調(diào)節(jié)線粒體aaRS活性為作用靶點(diǎn)，促進(jìn)體內(nèi)氨基酸代謝及糖脂代謝，這為臨床針刺治療PCOS的療效機(jī)制研究提供了分子生物學(xué)證據(jù)，對(duì)探索其參與的代謝通路及干預(yù)的作用靶點(diǎn)，揭示其分子生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。