胡凱莉 范欣 胡溫庭 李洪利 唐清華 孫學輝

1.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，濰坊261000；3.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔頜面外科，濰坊261000；4.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心，濰坊261053

舌鱗狀細胞癌是口腔鱗狀細胞癌最常見的類型[1]，其發(fā)展速度較快，相較于其他類型口腔鱗狀細胞癌更具有侵襲性[2]，舌鱗狀細胞癌可引起語言功能障礙、妨礙咀嚼、吞咽困難等口腔癥狀[3]。而且舌部血運豐富，活動頻繁，這些特殊的解剖結(jié)構(gòu)使得癌癥轉(zhuǎn)移率高于其他類型的口腔鱗狀細胞癌[4]。

據(jù)報道[5]，早期患者預后良好，但是如果發(fā)生隱匿性轉(zhuǎn)移，患者死于疾病的風險將增加5 倍，5年生存率由85.5%下降至48.5%。Wang 等[6]的研究表明，口腔鱗狀細胞癌的復發(fā)率為32.7%，只有31.8%的復發(fā)患者可以存活5 年，而在沒有復發(fā)的患者中，79.9%可以存活5 年。因此明確舌鱗狀細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制，可為臨床上抑制舌鱗狀細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的靶點和實驗依據(jù)。

肝癌細胞中分離出來的染色質(zhì)解旋酶DNA 結(jié)合蛋白（chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene，CHD1L），屬于氟化亞錫2家族的亞家族[7]。該家族蛋白主要參與細胞核活動，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，維持染色體完整性和DNA 修復[8]。CHD1L 在肝癌、食管鱗狀細胞癌和小細胞肺癌中表達異常，并且與腫瘤進展和預后具有顯著相關性[9-11]。本課題組前期實驗[12]證明，CHD1L 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有促進作用，但是CHD1L 在舌鱗狀細胞癌的表達及作用機制尚未明確闡述，因此本研究旨在探索CHD1L 在舌鱗狀細胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，有望為臨床抑制舌鱗狀細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、Beyo-ClickTMEdU 細胞增殖試劑盒（上海市碧云天生物技術有限公司）；β 肌動蛋白單克隆抗體、兔抗人CHD1L、上皮鈣黏著蛋白和波形蛋白單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；人正常皮膚細胞HaCaT 由濰坊醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心保存，人舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞由上海市口腔頜面部腫瘤組織樣本及生物信息數(shù)據(jù)庫專業(yè)技術服務平臺贈送。

1.2 方法

1.2.1 運用數(shù)據(jù)庫檢索CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌中的表達和與頭頸鱗狀細胞癌患者預后的關系 舌鱗狀細胞癌是頭頸鱗狀細胞癌主要亞型之一[13]，因數(shù)據(jù)庫未對頭頸鱗狀細胞癌詳細分組，因此擬通過檢索CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌的表達來評估CHD1L 在舌鱗狀細胞癌的表達。Ualcan 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)源于TCGA 數(shù)據(jù)庫，是一個包括31 種癌癥、數(shù)千個腫瘤樣本的基因數(shù)據(jù)。以“CHD1L”和“Head and Neck squamous cell carcinoma（HNSC）”為關鍵詞在Ualcan 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）檢索CHD1L 在HNSC 組織和正常組織的表達以及按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量分組后各組中的相對表達情況。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）中檢索頭頸鱗狀細胞癌患者CHD1L的表達與患者生存的關系。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27和人正常皮膚細胞HaCaT 用含10%胎牛血清的高糖型Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CHD1L 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法參照文獻[14]，將CHD1L 敲除質(zhì)粒和敲除對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進入人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27。將轉(zhuǎn)染后細胞命名如下：1）SiCHD1L/CAL27 組：轉(zhuǎn)入CHD1L 敲除質(zhì)粒；2）Scr/CAL27 組：轉(zhuǎn)入CHD1L 敲除對照質(zhì)粒。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測 為檢測人正常皮膚細胞HaCaT、人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27以及Scr/CAL-27 組細胞和SiCHD1L/CAL27 組細胞中CHD1L 的表達情況，使用裂解液將各組細胞裂解，提取總蛋白。上樣，進行十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），隨后參照蛋白標記切取蛋白β 肌動蛋白、CHD1L、上皮鈣黏著蛋白和波形蛋白對應的條帶，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。封閉，清洗，敷對應的一抗，4 ℃過夜。再次清洗后敷二抗，曝光。一抗抗體配制比例分別為CHD1L（1∶1 000）；上皮鈣黏著蛋白（1∶1 000）；波形蛋白（1∶1 000）；β肌動蛋白（1∶1 000）。

1.2.4 EdU 增殖實驗 為了分析CHD1L 對舌鱗癌細胞CAL27增殖能力的影響，使用帶有Alexa Fluor 594的BeyoClickTMEdU細胞增殖試劑盒進行EdU染色。首先用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）輕輕沖洗細胞，然后加入新鮮的常規(guī)培養(yǎng)基，再加10 μL EdU 工作液與培養(yǎng)液混勻。將細胞在37 ℃、5%CO2下孵育2 h。溫育后，再次用PBS 清洗細胞以除去培養(yǎng)基和游離的EdU探針。然后室溫下于4%多聚甲醛中固定15 min，PBS 清洗3 次。室溫下用含0.3% Triton X-100 的PBS孵育15 min。PBS清洗1～2次，加入200 μL 的點擊反應緩沖液、CuSO4、Azide 594 和點擊反應添加劑溶解液的混合物，孵育30 min，同時避光保存。PBS 清洗玻片，30 ℃避光條件下Hoechst 33342 染色10 min，吸出染色劑，PBS 再次洗滌后，激光共聚焦顯微鏡拍照。每組實驗重復3次。1.2.5 傷口愈合實驗 為檢測CHD1L 對人舌鱗癌細胞CAL27 遷移能力的影響，實驗將Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27 細胞懸液分別接種至六孔板中，并在完全培養(yǎng)基中生長至80%左右，用10 μL的槍頭沿直尺在六孔板中央劃條直線，PBS 洗滌幾次，含1%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在光學顯微鏡下拍攝照片，記錄愈合過程。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行處理，各組樣本間采用獨立樣本t檢驗，認為P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫檢測結(jié)果

通過Ualcan 網(wǎng)站分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中CHD1L在頭頸鱗狀細胞癌組織和正常上皮組織的差異表達情況，結(jié)果與正常上皮組織相比，CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌組織中表達升高（P＜0.000 1，圖1A），且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量＞9 個的頭頸鱗狀細胞癌患者的CHD1L 的表達量高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量≤3個的患者（P＜0.05，圖1B），結(jié)果表明：CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌中起著癌基因的作用，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。GEPIA 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果表明：高表達組的總生存率明顯低于低CHD1L 表達組（P=0.017，圖1C）。由此可見，CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用而且與患者預后相關。

2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測CHD1L的表達結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示：人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27中CHD1L的表達量明顯比在人正常皮膚細胞HaCaT 中的表達量高（P＜0.05，圖2 左），CHD1L 在SiCHD1L/CAL27 組細胞中的表達明顯低于Scr/CAL27組細胞中的表達（P＜0.05，圖2右）。

圖1 CHD1L在頭頸鱗狀細胞癌組織中的表達及與患者生存分析Fig 1 Expression of CHD1L in squamous cell carcinoma of the head and neck and its survival analysis

2.3 EdU增殖實驗結(jié)果

在激光共聚焦顯微鏡觀察下，EdU 陽性細胞表現(xiàn)為紅色，Hoechst 33342 染色細胞核呈藍色。EdU 增殖實驗檢測的結(jié)果顯示：SiCHD1L/CAL27組EdU 陽性的細胞百分比明顯低于Scr/CAL27 組，這表明在CHD1L敲除后，舌鱗狀細胞癌CAL27細胞的增殖能力明顯受到了一定的抑制（P＜0.05，圖3）。

2.4 傷口愈合實驗結(jié)果

通過對比同一視野下0 h 和24 h 的細胞照片發(fā)現(xiàn)，CHD1L 低表達使人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27的遷移能力明顯減弱（P＜0.05，圖4），這提示，CHD1L 在人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的遷移中發(fā)揮了促癌作用。

2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測EMT相關蛋白的表達結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示：SiCHD1L/CAL27細胞的上皮鈣黏著蛋白表達量明顯高于Scr/CAL27細胞，而波形蛋白表達量低于Scr/CAL27細胞（P＜0.05，圖5）。這表明，CHD1L 通過促進人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的EMT 進而使腫瘤細胞獲得侵襲性。

圖3 CHD1L對Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27增殖能力的影響Fig 3 Effect of CHD1L on the proliferation ability of Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells

圖4 CHD1L對Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27遷移能力的影響Fig 4 Effect of CHD1L on the migration ability of Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells

圖5 EMT相關蛋白在Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27的表達情況Fig 5 Expression of EMT related proteins in Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells

3 討論

舌鱗狀細胞癌是口腔頜面部高發(fā)腫瘤之一，約50%左右患者可以生存5 年，但是TNM-Ⅳ期患者僅15%的患者可生存5 年[15]。據(jù)報道[16-17]，侵襲性及高轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因，所以明確舌鱗狀細胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制有助于臨床舌鱗狀細胞癌的診治。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CHD1L對乳腺癌進展具有明顯促進作用，為了解CHD1L對舌鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的影響，本實驗首先通過生物信息學技術，明確了CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌的表達情況及其對患者預后的影響。通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫信息發(fā)現(xiàn)，CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌中的表達比在正常上皮組織內(nèi)高，且CHD1L的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，該結(jié)果表明CHD1L 可能對頭頸鱗狀細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移有促進作用。通過分析GEPIA 數(shù)據(jù)信息顯示，CHD1L 的高表達可引起患者不良預后。

為了解CHD1L 在人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27中的表達情況，進一步進行了蛋白質(zhì)印跡實驗，發(fā)現(xiàn)CHD1L在人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27中表達比在人正常皮膚細胞HaCaT 中表達量高，這與生物信息學結(jié)果的趨勢相符。為進一步了解CHD1L對人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 侵襲轉(zhuǎn)移的影響，實驗運用常規(guī)的RNA 干擾方法，敲除了人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 中CHD1L 的表達，檢測了CHD1L 對人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 增殖和遷移能力的影響，結(jié)果顯示CHD1L 表達降低后，人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的增殖能力和遷移能力明顯降低，這表明CHD1L 可以增加舌鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移能力。

EMT 使細胞之間失去細胞接觸，進而獲得遷移能力，控制癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。Lyons等[19]通過將不同熒光標記的EMT 細胞和非EMT 細胞混合，進行小鼠皮下注射，發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的侵襲特點僅與源自EMT 細胞的腫瘤侵襲性一致，且EMT細胞協(xié)助了非EMT 細胞侵入血管。波形蛋白、鋅指轉(zhuǎn)錄因子2 和上皮鈣黏著蛋白等蛋白既是EMT激活因子又是EMT 特征性標志物，常通過檢測這些標志物的變化來反映EMT 過程[16]。有研究[20]證實，相較于癌前病變和正常上皮來說，皮膚鱗狀細胞癌細胞膜上的上皮鈣黏著蛋白表達量明顯上調(diào)。此外還有研究[21]顯示，波形蛋白和β-連環(huán)蛋白等蛋白在轉(zhuǎn)移性皮膚鱗狀細胞癌內(nèi)表達上調(diào)，而上皮鈣黏著蛋白下調(diào)。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)，舌鱗狀細胞癌中存在EMT，并且對舌鱗狀細胞癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有促進作用。CHD1L 最早被發(fā)現(xiàn)于肝癌細胞，與腫瘤的進展和患者預后具有明顯相關性[23-24]。本課題組前期實驗[12]表明，微小RNA-504靶向調(diào)控CHD1L 的表達，進而能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲。Chen等[23]通過動物實驗則發(fā)現(xiàn)，CHD1L 通過增加細胞運動并通過鳥嘌呤核苷酸交換因子基因介導的Cdc42，激活誘導絲狀偽足形成和EMT，來促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且他們還在人肝癌組織侵襲性前端發(fā)現(xiàn)了CHD1L 表達量的增加。本實驗結(jié)果顯示，敲低CHD1L 表達后，人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的EMT 相關蛋白上皮鈣黏著蛋白表達量增高和波形蛋白表達量降低，這表明CHD1L 可以促進舌鱗狀細胞癌細胞的EMT。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CHD1L 在舌鱗狀細胞癌細胞中特異性高表達，并且能夠促進舌鱗狀細胞癌細胞EMT，進而提高腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此，CHD1L 在影響舌鱗狀細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移方面起著重要的促進作用。此研究有望為臨床抑制舌鱗狀細胞癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。