黃盛 張七援 何愛娥 李洪波 張智星

1.武漢理工大學馬房山校區(qū)東院醫(yī)院口腔科，武漢430000；2.武漢大學口腔醫(yī)院牙體牙髓二科，武漢430000；3.武漢市第五醫(yī)院口腔科，武漢430000；4.武漢大學口腔醫(yī)院修復科，武漢430000；5.同濟醫(yī)科大學附屬醫(yī)院口腔科，武漢430000

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是全球范圍內最廣泛發(fā)生的癌癥之一，約占頭頸部腫瘤的38%和所有口腔惡性腫瘤的90%以上[1]。早期患者的5 年生存率為55%～60%，而晚期患者的5 年生存率降至30%～40%[2]。隨著診療技術的不斷提高，OSCC的存活率有所提高，但在癌癥治療中仍存在非特異性、非選擇性和毒性的巨大挑戰(zhàn)。在接受手術、放療和/或化療后，大多數(shù)患者會遭受局部缺陷、畸形、功能障礙、耐藥性以及其他無法忍受的毒性和不良反應。OSCC復發(fā)率高，并且易于轉移，導致患者生活質量下降[3]。因此，OSCC 需要更好的治療，靶向治療可能會作為治療的輔助手段提供最佳選擇[4]。性別決定區(qū)Y 框蛋白9 （sex determining region Ybox 9，SOX9）是一個SOX 家族轉錄因子的成員，在各種組織的發(fā)育和分化中起關鍵作用[5]。最近，SOX9 被證明參與了各種類型癌癥的發(fā)生或發(fā)展，包括前列腺癌[6]、乳腺癌[7]和腎細胞癌[8]、皮膚基底細胞癌[9]和食管癌[10]。然而，SOX9的表達對OSCC的作用機制仍不清楚。因此，本研究探索SOX9對人OSCC 細胞CAL27 微管形成和上皮間質轉化的影響及其作用機制，以期為OSCC的靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶（Invitrogen公司，美國）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（PIERCE 公司，美國）；MatrigelTM底膜基質（BD 公司，美國）；波形蛋白（Vimentin）、鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin)、Wnt、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和T 細胞4（T-cell factor-4，TCF-4）抗體、HRP標記的山羊抗兔二抗（NEB公司，美國）；高速低溫離心機（Beckman 公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）；電泳槽、電轉儀（Bio-Rad 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（TS100）（Nicon 公司，日本）；凝膠成像系統(tǒng)GDS-800 UVP （UVP 公司，美國）；ChemiDoc XRS凝膠/發(fā)光圖像分析儀（Bio-Rad公司，美國）；Olympus DP71 免疫熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。SOX9-shRNA1 和SOX9-shRNA2 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；實驗所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

CAL27 細胞株由中國科學院上海細胞生物學研究所上海細胞庫提供，在有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中生長。當所有細胞融合至80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶分離傳代，然后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的細胞進行進一步實驗。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉染 將CAL27 細胞傳代培養(yǎng)于6 孔板中并分為4 組：對照組、Scramble（shRNA-NC）組、SOX9-shRNA1 組、SOX9-shRNA2 組。培養(yǎng)24 h 后根據(jù)轉染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，Carlsbad，CA）根據(jù)組名分別轉染SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2，48 h后進行相應檢測。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 使 用TRIzol 試劑提取總RNA，并通過超微量紫外分光光度計在260和280 nm處測定光密度（optical density，OD）值。按照試劑盒說明書，使用Super RT cDNA 試劑盒合成cDNA。此外，使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit 進 行 聚 合 酶 鏈 反 應（polymerase chain reaction，PCR），分別在95 ℃15 s 和60 ℃60 s 條件下使用ABI 7500 將反應激活，結果采用2-ΔΔCt法進行計算。用于該反應的SOX9 和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）的引物序列如下。SOX9 上游引物序列：5’-CAAGAAGGACCACCCGGATT-3’，下游引物序列：5’-AAGATGGCGTTGGGGGAGAT-3’；GAPDH 上游引物序列：5’-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3’，下游引物序列：5’-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3’。

1.3.3 微管形成實驗 測定體外微管形成以確定中性粒細胞的促血管生成能力。在37 ℃下，每孔在48 孔培 養(yǎng)板 上預 涂5 mg·mL-1基 質 膠（Matrigel）30 min，以使其硬化。將融合的細胞以密度為每毫升1.5×105個在37 ℃的條件下懸浮于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。然后使用Olympus DP71 免疫熒光顯微鏡對毛細管狀結構進行拍照并進行測量。

1.3.4 細胞形態(tài)學觀察 在倒置相差顯微鏡下觀察處于對數(shù)生長期的CAL27 細胞，并且記錄細胞形態(tài)。

1.3.5 免疫印跡法 使用裂解緩沖液裂解細胞樣品。然后，使用BCA 蛋白質測定試劑盒定量蛋白質濃度。含有20 mg蛋白質的樣品在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）中分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下將膜在封閉緩沖液（5%脫脂奶粉和PBS 中的1%Tween-20）中封閉2 h，然后與適當?shù)囊豢梗‥cadherin，1∶1 000；N-cadherin，1∶1 000；Fibronectin，1∶1 000）在封閉緩沖液中于4 ℃孵育過夜。隨后，將膜用含Tween-20 的TBS 洗滌以除去上述殘留的一抗，并與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG二級抗體一起孵育，最后進行化學發(fā)光反應，顯影，定影，根據(jù)二抗結合情況調節(jié)曝光參數(shù)，Image J 掃描目的條帶的灰度值，以內參為基數(shù)，其他條帶灰度值與內參灰度值之比為相對蛋白表達水平。

1.3.6 免疫熒光檢測Vimentin的含量 將CAL27細胞接種到涂有纖連蛋白的玻璃蓋玻片上。在培養(yǎng)24 h 后，PBS 沖洗細胞，固定于預冷甲醇中，0.2% Triton X-100 滲透。固定細胞在1.5%的正常山羊血清中預孵育，4 ℃下用一抗Vimentin（1∶100 稀釋）孵育過夜。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記山羊抗兔IgG 抗體37 ℃孵育2 h 后，DAPI 染核5 min，將蓋玻片用PermaFluor Aqueous 固定在載玻片上。使用Olympus DP71 顯微鏡觀察熒光，計數(shù)可觀察到熒光信號的陽性細胞。

1.3.7 熒光素酶報告實驗檢測Wnt 通路激活細胞按照前面的分組方法分組培養(yǎng)24 h 后，根據(jù)轉染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000 根據(jù)組名分別轉染SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2，同時共轉染TCF Reporter Plasmid（TOPFLASH），轉染48 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒提供的方法檢測報告質粒熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析進行檢驗。實驗結果以均數(shù)±標準差表示。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 干擾SOX9抑制SOX9的表達

與對照組比較，SOX9-shRNA1組和SOX9-sh-RNA2組SOX9 mRNA和蛋白的表達顯著降低（F=578.000，P=0.000；F=96.850，P=0.000）（圖1）。

2.2 干擾SOX9抑制微管形成

微管形成實驗結果表明，對照組清晰可見大量緊密排列的微管結構，而SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組細胞微管樣結構的形成數(shù)量明顯減少，且微管的環(huán)狀結構不完整或不典型（圖2）。與對照組（55.91±6.23）相比較，SOX9-shRNA1組（21.78±4.19）和SOX9-shRNA2組（15.46±3.41）微管結節(jié)數(shù)目顯著減少（F=91.200，P=0.000）。

2.3 干擾SOX9對上皮間質形態(tài)的影響

各組細胞形態(tài)變化見圖3。由圖3 可見，對照組多為梭形的間質樣細胞，少量橢圓形或圓形的上皮樣細胞。與對照組相比，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組CAL27 間質樣細胞減少，上皮樣細胞增多（圖3）。

圖1 OSCC細胞中SOX9的表達水平Fig 1 The expression levels of SOX9 in OSCC

圖2 微管結節(jié)數(shù)目的變化 免疫熒光顯微鏡 ×100Fig 2 Changes in the number of microtubule nodules immunofluorescence microscope ×100

圖3 細胞形態(tài)的觀察結果 倒置相差顯微鏡 ×400Fig 3 Observation of cell morphology changes inverted phase contrast microscope ×400

2.4 干擾SOX9抑制上皮間質轉化

由Western blot 條帶可見，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組E-cadherin 蛋白表達量較對照組升高，N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達量較對照組降低（圖4）。Western blot 灰度分析結果見表1。與對照組比較，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組E-cadherin 蛋白表達水平顯著升高（F=181.400，P=0.000）；N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達水平顯著降低（N-cadherin：F=101.400，P=0.000；Fibronectin：F=122.300，P=0.000）。

圖4 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin蛋白表達量Fig 4 The protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，F(xiàn)ibronectin

2.5 干擾SOX9降低OSCC中Vimentin的含量

免疫熒光染色結果發(fā)現(xiàn)對照組細胞的Vimentin熒光標記主要濃集于核區(qū)，胞質區(qū)減少；SOX9-shRNA1 組 和SOX9-shRNA2 組 細 胞 的Vimentin 熒光標記主要濃集于胞質區(qū)，核區(qū)減少，沒有明顯顯現(xiàn)（圖5）。與對照組（29.63±3.75）比較，SOX9-shRNA1組（3.09±1.18）和SOX9-shRNA2組（1.82±1.03）Vimentin 陽性細胞數(shù)顯著減少（F=169.700，P=0.000）。

2.6 干擾SOX9 抑制Wnt、β-catenin、TCF-4 的蛋白表達

Wnt、β-catenin、TCF-4 的蛋白表達結果見表2 和圖6。由Western blot 條帶可見，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組Wnt、β-catenin、TCF-4蛋白表達量較對照組降低。此外，從熒光素酶報告實驗結果可見，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組TCF 報告質粒熒光素酶活性較對照組降低（F=94.830，P=0.000）。免疫印跡灰度分析結果可見，與對照組比較，SOX9-shRNA1 組和SOX9-shRNA2 組Wnt、β-catenin、TCF-4 蛋白表達水平顯著降低（Wnt：F=70.290，P=0.000；β-catenin：F=81.740，P=0.000；TCF-4：F=37.020，P=0.000）。

表1 半定量分析E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin蛋白表達水平變化Tab 1 Semi-quantitative analysis of E-cadherin，N-cadherin，F(xiàn)ibronectin protein expression levels changes %

圖5 免疫熒光檢測Vimentin的陽性表達量 免疫熒光染色 ×400Fig 5 Immunofluorescence detect the positive expression of Vimentin immunofluorescence staining ×400

表2 半定量分析Wnt、β-catenin和TCF-4蛋白表達水平變化Tab 2 Semi-quantitative analysis of Wnt，β-catenin and TCF-4 protein expression levels changes

圖6 Wnt、β-catenin和TCF-4蛋白表達量Fig 6 The protein expression levels of Wnt，β-catenin and TCF-4

3 討論

OSCC起源于口腔上皮，是頭頸部最常見的惡性腫瘤。盡管OSCC的治療取得了很大進展，但它仍然是一種具有高復發(fā)風險和預后不良的致死性疾病[11]。外科手術技術、放射療法和多藥化療是目前OSCC最常見的治療方法。然而，耐藥的存在和發(fā)展在很大程度上限制了化療藥物的臨床應用[12]。SOX9 被證明參與各種類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展，癌細胞中SOX9 高表達與不良的臨床結果呈正相關[13]。而目前有研究[14]發(fā)現(xiàn)SOX9 可能在OSCC 的癌變發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究進一步探索SOX9對人OSCC細胞CAL27微管形成和上皮間質轉化的影響及其作用機制，尋找對OSCC新的靶向治療策略。

SOX9 的異常表達已在一些人類癌癥中被觀察到。SOX9 在癌癥進展中發(fā)揮關鍵作用，它調節(jié)一系列的基因轉錄，促進細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成[15]。研究[16]發(fā)現(xiàn)SOX9 可以抑制NBAT1的表達，NBAT1 過表達能引起毛細血管形成明顯減少，而SOX9 可通過抑制NBAT1 促進毛細血管形成。與其他研究結果相似，本研究發(fā)現(xiàn)干擾SOX9 細胞微管樣結構的形成數(shù)量明顯減少，表明SOX9可誘導OSCC細胞CAL27微管形成。

上皮-間充質轉化發(fā)生在上皮腫瘤的進展過程中，以增加癌細胞的遷移性和侵襲性。上皮-間充質轉化的一個特殊特征是上皮標記物E-cadherin 的下調和間質標記物如Vimentin、Fibronectin 和Ncadherin 的增加[17]。研究發(fā)現(xiàn)敲除SOX9 可明顯抑制甲狀腺癌細胞的侵襲和遷移以及Vimentin 和Ncadherin 的表達，并上調E-cadherin 的表達[18]。同樣，Huang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)在SOX9 基因敲除的細胞中，上皮細胞標志物E-cadherin 和γ-catenin 的表達在蛋白水平上調而間質細胞標志物Vimentin 和Ncadherin 的表達下調[19]。與其他研究結果相似，本研究發(fā)現(xiàn)干擾SOX9 后E-cadherin 蛋白表達水平升高，N-cadherin 和Fibronectin 蛋白表達水平降低，OSCC 細胞中Vimentin陽性細胞數(shù)減少，表明干擾SOX9能抑制OSCC上皮間質轉化過程。

在經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導中，Wnt配體與其同源膜受體的結合導致β-catenin 降解復合物失活，從而導致細胞質β-catenin 的穩(wěn)定。一旦積累，β-catenin 就會定位于細胞核，并與DNA 結合蛋白的Lef-1/TCF 家族相互作用，從而生成功能性轉錄因子復合物[20]。β-catenin與細胞核中TCF/LEF家族的轉錄因子結合，從而調節(jié)靶基因的表達[21]。據(jù)報道，異常的Wnt/β-catenin 信號轉導與多種人類癌癥之間存在關聯(lián)[22]。已經(jīng)顯示出Wnt/β-catenin信號傳導會影響OSCC 細胞的增殖、分化以及上皮-間質轉化[23]。與其他研究結果一致，本研究發(fā)現(xiàn)干擾SOX9 明顯抑制Wnt、β-catenin、TCF-4 的蛋白表達，同時熒光素酶報告實驗結果顯示，干擾SOX9可降低TCF報告質粒熒光素酶活性，表明Wnt/β-catenin通路的激活明顯受到抑制，上述結果說明SOX9 影響OSCC 的發(fā)展與Wnt/β-catenin 信號通路激活抑制存在一定的聯(lián)系。

綜上所述，本研究通過干擾SOX9 降低了Vimentin 的含量，抑制微管形成，上皮間質轉化標記分子的蛋白表達，并抑制了Wnt/β-catenin 通路的激活，表明SOX9可誘導人OSCC細胞CAL27微管形成和上皮間質轉化，這一作用與Wnt/β-catenin通路激活抑制存在一定的聯(lián)系，有待后續(xù)研究進一步探索，為臨床上OSCC 的靶向治療提供實驗依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。