孫儀庭 陳思悅 陳 昱 王天鴿 周志捷 林開利 劉加強(qiáng)

鈦及其合金具有優(yōu)良的力學(xué)性能，作為硬組織替代材料被廣泛應(yīng)用于口腔種植和骨缺損修復(fù)等領(lǐng)域［1］。然而，鈦合金與周圍組織結(jié)合強(qiáng)度低，表面無(wú)法直接成骨，會(huì)影響植入物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

與其他如等離子噴涂、電化學(xué)沉積法、溶膠-凝膠法等表面改性方法［2-4］不同，仿生礦化法是指通過具有和人體血液相似的PH值以及離子組成的模擬體液中，促進(jìn)材料表面的離子沉積形成羥基磷灰石。該成分與天然骨的無(wú)機(jī)結(jié)構(gòu)相似，能強(qiáng)化鈦合金與周圍組織的骨結(jié)合［5,6］。

鍶（Sr）與鈣（Ca）有相似的物理和化學(xué)特性，是參與骨骼形成過程的微量元素之一［7］，被證實(shí)有影響骨吸收以及骨形成的雙重作用［8-10］。當(dāng)兩者同時(shí)存在時(shí)，Sr2+會(huì)替代部分Ca2+形成新的晶體，稱摻鍶羥基磷灰石，提高鈦合金的生物相容性和成骨能力［11,12］。

通過鄰苯二酚和氨基功能基團(tuán)發(fā)生氧化-聚合等反應(yīng),形成的聚多巴胺薄膜具有良好黏附作用［13,14］。吸附鈦表面的聚多巴胺分子能夠與模擬體液里的鈣離子螯合，通過靜電作用將Ca2+與PO43-結(jié)合形成羥基磷灰石［15,16］。

為此，本實(shí)驗(yàn)擬采用聚多巴胺仿生礦化法，利用聚多巴胺良好的黏附能力，增強(qiáng)模擬體液中離子與材料表面的結(jié)合，改善羥基磷灰石涂層的厚度和穩(wěn)定性。同時(shí)摻入一定比例的鍶離子，于鈦合金表面制備摻鍶羥基磷灰石涂層。通過一系列體外實(shí)驗(yàn)探究材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)性能的調(diào)控作用。

1.材料及方法

1.1 聚多巴胺及摻鍶羥基磷灰石涂層的制備

1.1.1 鈦片清洗 根據(jù)文獻(xiàn)［17］將鈦片（10mm×10mm×2mm）用砂紙打磨拋光后以丙酮、無(wú)水乙醇及去離子水超聲清洗。反復(fù)3次后，室溫晾干鈦片。

1.1.2 制備聚多巴胺涂層 將鹽酸多巴胺（Sigma Aldrich）溶解在Tris溶液（10mM，PH=8.5）制備成2g/L多巴胺溶液［18］。把超聲清洗完的鈦合金材料置于溶液，室溫避光反應(yīng)24h。取出后用大量去離子水反復(fù)清洗去除未附著的聚多巴胺單體，室溫干燥。

1.1.3 摻鍶羥基磷灰石涂層制備 首先根據(jù)Kokubo等［19］先前的研究制備1.5倍模擬體液（1.5×SBF,Na+213.0;Ca2+3.75,Cl?221.7,HPO42?1.5,K+7.5 Mg2+2.25,SO42?0.75,HCO3-6.3 mM)。按照Sr2+/(Sr2++Ca2+)=10%的比例用鍶離子替代鈣離子,制備含鍶模擬體液（PH=7.4)［12］。將上述聚多巴胺修飾的鈦合金材料浸泡至該溶液,放置于37℃恒溫?fù)u床反應(yīng)，每?jī)商旄鼡Q新的模擬體液保證一定的離子濃度。7d后取出鈦片，大量去離子水沖洗，室溫干燥。

1.2 材料表征 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM;S-4800,Hitachi）觀察噴金處理后各組材料的表面形貌；通過X 射線光電子能譜（XPS;EscaLab250,Thermo）測(cè)定不同樣品的表面元素組成；借由拉曼光譜（Raman;RW2000,Renishaw）在波長(zhǎng)532nm處驗(yàn)證PDA是否成功負(fù)載；X射線衍射分析（XRD;Buker D8,ADVANCE）測(cè)定材料的化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)，2θ角范圍：10-90°，掃描速率：6°/min，掃描步長(zhǎng)：0.02；通過接觸角測(cè)角儀（WCA;SL200B;Kono）測(cè)定各組材料的水接觸角。

1.3 BMSCs的細(xì)胞黏附和增殖

1.3.1 CLSM用于檢測(cè)BMSCs細(xì)胞骨架的絲狀肌動(dòng)蛋白 將鈦片、聚多巴胺修飾鈦片、聚多巴胺-羥基磷灰石修飾鈦片以及聚多巴胺-摻鍶羥基磷灰石修飾鈦片共4種材料置于24孔板，并以2×104/孔密度將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于材料表面。使用含有10%胎牛血清以及雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后吸取培養(yǎng)基。加入4%多聚甲醛固定30min，接著用1%TritonX-100孵育10min，然后用PBS漂洗。1%牛血清白蛋白封閉30min后，配制一定濃度的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（Sigma Aldrich)，并加入各組樣品，在37℃下孵育30min。之后，將樣本用PBS洗滌后，加入DAPI室溫孵育10min，再次用PBS洗滌。隨后借由激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的鋪展形態(tài)。

1.3.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 按照1×104/孔密度將細(xì)胞接種于材料表面。分別在第1、4和7d進(jìn)行細(xì)胞增殖測(cè)定。吸除培養(yǎng)基并用PBS漂洗。向每孔加入等體積的含溴化-3-(4，5-2甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑（MTT）的培養(yǎng)基，避光孵育4h。之后棄上清，加入同體積DMSO室溫孵育15min并振蕩，而后吸取100μL溶液轉(zhuǎn)移至新96孔板，用酶標(biāo)儀（Multiskan FC，Thermo Scientific）在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

1.4 BMSCs的成骨分化

1.4.1 細(xì)胞堿性磷酸酶活性半定量及定性檢測(cè) 通過ALP染色及半定量實(shí)驗(yàn)探究各組材料對(duì)細(xì)胞成骨分化能力的影響。以2×104/孔密度將BMSCs接種于材料表面進(jìn)行共培養(yǎng)。1d后改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

于第4d終止培養(yǎng)。加入1% Triton-100X裂解并12000rpm/min離心10min，提取上清液，根據(jù)試劑盒的說明測(cè)定不同組的細(xì)胞堿性磷酸酶活性。第7d棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗后用4%多聚甲醛固定30min，根據(jù)BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4.2 成骨基因相對(duì)表達(dá)qPCR 將BMSCs與四組材料共培養(yǎng)，24h后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。分別在細(xì)胞與材料成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4和第7d提取總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書（Takara，Japan）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在Light Cycler 96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Roche，Switzerland）上使用SYBR green PCR反應(yīng)混合物（Roche，Switzerland）研究聚多巴胺仿生摻鍶羥基磷灰石涂層對(duì)細(xì)胞的成骨分化能力的影響。檢測(cè)RUNX2、ALP、COL-I和BSP等成骨相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。通過單因素方差分析（One Way ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 材料表征檢測(cè)結(jié)果 圖1顯示材料實(shí)物圖以及掃描電鏡觀察的表面形貌?？梢娾伜辖穑═i）組表面相對(duì)光滑，聚多巴胺修飾后的鈦合金（Ti@PDA）在低倍鏡下形貌與鈦合金組相似，在高倍鏡下可見均勻分散的球形顆粒，為納米尺寸。聚多巴胺-羥基磷灰石組（Ti@PDA+SBF）表面凹凸不平，可見呈針葉狀的納米顆粒晶體層層堆疊于材料表面。聚多巴胺-摻鍶羥基磷灰石組（Ti@PDA+SBF(Sr)）在高倍鏡下顯示礦物層形成，為球狀納米顆粒的團(tuán)聚。

圖1 (A）各組材料的實(shí)物圖;(B）材料的掃描電鏡圖

圖2依次顯示了鈦合金組、聚多巴胺-鈦合金組、聚多巴胺-羥基磷灰石組以及聚多巴胺-摻鍶羥基磷灰石組表面元素的X射線光電子能譜（XPS）結(jié)果。不同的修飾階段呈現(xiàn)不同的變化，鈦合金組主要呈現(xiàn)Ti，O和C的峰。與先前的文獻(xiàn)結(jié)果一致，修飾聚多巴胺后XPS結(jié)果記錄明顯的N峰，且Ti明顯減弱，側(cè)面證實(shí)PDA的均勻涂覆［20］。在SBF溶液中浸泡后，Ca(2p，2s）和P(2p，2s）峰的強(qiáng)度顯著增加，這表明在PDA膜上形成了磷酸鈣化合物。Ca2p和P2p峰的存在，說明有類羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)［21］。Sr3p特征峰的出現(xiàn)則證明鍶離子的成功負(fù)載。

圖2 X線光電子能譜分析各組材料表面的元素組成

如圖3 拉曼光譜所示：在1350cm-1和1580cm-1波長(zhǎng)處，聚多巴胺-鈦合金組樣品表面可見聚多巴胺的特征峰，由此可進(jìn)一步證明聚多巴胺成功地沉積在鈦合金組樣品表面［22］。

Ti@PDA+SBF 和Ti@PDA+SBF(Sr）的XRD譜（圖4）顯示仿生礦化后于2θ=26°和2θ=32°處出現(xiàn)了HA 的特征衍射峰。與Ti@PDA+SBF 組相比，Ti@PDA+SBF(Sr）組的HA 特征衍射峰強(qiáng)度減弱，說明涂層的結(jié)晶性降低。

從圖5 接觸角測(cè)量的結(jié)果來看，Ti 組的接觸角角度最大，與各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再者是Ti@PDA 組，其 次 是Ti@PDA+SBF(Sr）組。Ti@PDA+SBF 組的接觸角測(cè)量值最小。后三組兩兩之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。一般認(rèn)為接觸角角度越小，親水性越高。

圖3 各組材料的拉曼光譜

圖4 各組材料的X射線衍射圖譜分析

2.2 各組材料表面的細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖 材料植入后會(huì)與周圍組織直接接觸，是否具有良好的生物相容性至關(guān)重要。圖6 為BMSCs 在各組材料表面早期黏附的情況?？梢奣i 組表面細(xì)胞多呈梭形，細(xì)胞鋪展面積較小，偽足伸展少。Ti@PDA+SBF 組表面細(xì)胞數(shù)量略多余對(duì)照組，且細(xì)胞鋪展面積有所增加。Ti@PDA+SBF(Sr）以及Ti@PDA 兩組材料上的BMSCs 鋪展面積顯著大于Ti 組，表現(xiàn)出融合，多層和聚集的形態(tài)。此外，細(xì)胞通過更多的肌動(dòng)蛋白絲與相鄰細(xì)胞相連，可見絲狀偽足伸展，而聚多巴胺-摻鍶羥基磷灰石組表面細(xì)胞密度略大于聚多巴胺-鈦合金組。細(xì)胞早期完全鋪展有利于后續(xù)細(xì)胞的增殖和分化。

圖5 各組材料的水接觸角測(cè)量比較，采用單因素方差分析比較各組材料的水接觸角，*代表與Ti組比較P＜0.05，#代表與Ti@PDA+SBF(Sr）比較P＜0.05

圖6 (A)Ti(B)Ti@PDA(C)Ti@PDA+SBF(D)Ti@PDA+SBF(Sr),大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)24h的CLSM圖

圖7為BMSCs在Ti、Ti@PDA、Ti@PDA+SBF和Ti@PDA+SBF(Sr）上培養(yǎng)1、4和7d后的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖中可見每組細(xì)胞均有良好的增殖能力，細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)?？傮w來說Ti@PDA組表面細(xì)胞增殖最為顯著，與Ti組相比在第1、4和7d均顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05)。Ti@PDA+SBF(Sr）組有著相似的結(jié)果，但兩組之間無(wú)顯著性差異。Ti@PDA+SBF 組在第4d的細(xì)胞數(shù)較低于Ti組，而第1和7d 的結(jié)果略高，但兩組細(xì)胞數(shù)量均無(wú)明顯差異。研究表明細(xì)胞在材料表面的黏附和伸展有利于細(xì)胞增殖。而圖7 MTT結(jié)果也顯示細(xì)胞在Ti@PDA和Ti@PDA+SBF(Sr）組有更好的增殖能力，這與細(xì)胞在材料表面鋪展結(jié)果（圖6）相一致。

圖7 BMSCs在各組材料表面培養(yǎng)1、4和7d的增殖情況,采用單因素方差分析比較各組吸光度，*P＜0.05

2.3 細(xì)胞ALP 活性 圖8 所示為成骨誘導(dǎo)4d 后各組材料表面細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。Ti@PDA組的ALP 水平略高于Ti 組，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ti@PDA+SBF 組的ALP 水平高于Ti@PDA 以及Ti 組，Ti@PDA+SBF(Sr）組表面BMSCs 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性明顯高于其他3 組（P＜0.05)，說明有更好的促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的能力。

ALP 定性結(jié)果如圖9 所示，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，Ti@PDA+SBF(Sr）組染色最深，其次為Ti@PDA+SBF 組，再者是Ti@PDA 組，最后是對(duì)照組。整體趨勢(shì)與細(xì)胞堿性磷酸酶活性半定量測(cè)試結(jié)果一致，證明聚多巴胺仿生的摻鍶羥基磷灰石涂層能較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。ALP 是BMSCs早期成骨分化的標(biāo)志，是參與骨形成過程的重要酶之一，與成骨細(xì)胞的分化有正向關(guān)系。ALP活性越高說明成骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化越顯著。結(jié)果說明經(jīng)聚多巴胺修飾和復(fù)合鍶離子的羥基磷灰石涂層有望提高成骨活性。

圖8 不同材料表面的細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)4d后的細(xì)胞堿性磷酸酶活性。采用單因素方差分析比較各組的ALP活性，*代表與Ti組比較P＜0.05，#代表與Ti@PDA+SBF(Sr）比較P＜0.05

2.4 BMSCs 成骨相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè) 圖10為BMSCs在各組材料表面培養(yǎng)4 和7d 時(shí)成骨相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。在第4d，Ti@PDA+SBF(Sr）組細(xì)胞的各基因表達(dá)量均高于對(duì)照組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。第7d 各組材料表面細(xì)胞的基因表達(dá)量均有所升高，其中Ti@PDA+SBF(Sr）組升高更為顯著，且與其他三組的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明聚多巴胺仿生摻鍶羥基磷灰石涂層促進(jìn) 了RUNX2、ALP、COL-I 和BSP 成 骨 因 子 的表達(dá)。

圖9 (A)Ti(B)Ti@PDA(C)Ti@PDA+SBF(D)Ti@PDA+SBF(Sr）不同材料表面的細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后的ALP定性結(jié)果

圖10 細(xì)胞在不同材料表面成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)4和7d，成骨相關(guān)基因表達(dá)情況。采用單因素方差分析比較各組的相對(duì)基因表達(dá)量，*代表與Ti組比較P＜0.05，#代表與Ti@PDA+SBF(Sr）比較P＜0.05

3.討論

鈦及鈦合金是骨/齒科廣泛應(yīng)用的硬組織替代材料。理想的植入體在植入體內(nèi)后應(yīng)起到良好的骨引導(dǎo)作用，便于做到骨性結(jié)合。對(duì)其進(jìn)行表面改性旨在做到植入體能夠即刻負(fù)載，有良好的骨整合性并且滿足長(zhǎng)期穩(wěn)定性的需求［23］。

羥基磷灰石是動(dòng)物和人骨骼的主要無(wú)機(jī)組成成分［24］，作為人體骨骼中最常見的磷酸鈣鹽并且與骨骼中礦物相的化學(xué)組成成分相似，同時(shí)具備理想生物相容性以及骨誘導(dǎo)性。研究普遍認(rèn)為磷灰石類材料相對(duì)于鈦合金材料能更早的達(dá)到骨整合，但負(fù)載能力較差。為了結(jié)合鈦合金優(yōu)秀的力學(xué)性能以及羥基磷灰石涂層良好的骨引導(dǎo)能力，關(guān)于鈦及羥基磷灰石涂層的復(fù)合材料倍受關(guān)注［25］。目前的電化學(xué)沉積法、等離子噴涂和微弧氧化法等可以一定程度改善形成的羥基磷灰石涂層的結(jié)合強(qiáng)度和形態(tài)結(jié)構(gòu)以優(yōu)化鈦合金材料［26,27］。

仿生礦化法于20世紀(jì)90年代首次被提出，通過將材料直接浸入具有與人體血液相近的PH值和無(wú)機(jī)成分模擬體液中形成羥基磷灰石結(jié)構(gòu)。優(yōu)點(diǎn)在于制備方法簡(jiǎn)單溫和，不受限于材料本身［20］。根據(jù)羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)特性，我們可以通過復(fù)合不同離子改善羥基磷灰石涂層的生物活性和穩(wěn)定性。骨骼中含有多種微量元素，低劑量的鍶離子可以促進(jìn)成骨及成血管作用［28,29］。其中鍶離子的半徑小于鈣離子，可以取代部分鈣離子摻入羥基磷灰石晶格并在骨形成和礦化中起重要作用。

聚多巴胺在貽貝中首次被發(fā)現(xiàn)，是多巴胺的衍生物之一，可以通過簡(jiǎn)單的方法在弱堿性條件下自聚合［30］。帶有PDA涂層的植入物表面親水性更佳，有利于蛋白的吸附和細(xì)胞反應(yīng)，例如促進(jìn)細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖［31］。聚多巴胺直接影響?zhàn)ぶ叩鞍椎谋磉_(dá)，經(jīng)FAK/MAPK途徑涉及BMSCs成骨分化過程，因此認(rèn)為具有聚多巴胺涂層的植入物在體內(nèi)有優(yōu)秀的直接骨結(jié)合能力［22,32］。聚多巴胺含有多種鄰苯二酚基團(tuán)和氨基活性基團(tuán)，與物體之間可以通過各種化學(xué)鍵產(chǎn)生結(jié)合［33-35］，其末端豐富的酚羥基和醌基，能夠螯合模擬體液中的Ca2+形成有機(jī)金屬絡(luò)合物并進(jìn)一步吸附PO43-，加強(qiáng)羥基磷灰石在聚多巴胺薄膜表面的沉積和穩(wěn)定性。

與其他復(fù)雜的表面改性方法相比，在本研究中，我們關(guān)注具有良好黏附能力聚多巴胺，通過構(gòu)建該涂層加強(qiáng)仿生礦化工藝過程離子的沉積從而穩(wěn)定形成的羥基磷灰石結(jié)構(gòu)。向模擬體液中摻入一定比例的鍶離子改變涂層的成分，進(jìn)一步促進(jìn)其促成骨的能力。

從掃描電鏡觀察材料表面形貌的結(jié)果來看，聚多巴胺顆粒以及羥基磷灰石能均勻的修飾到鈦合金表面。同先前的研究一致發(fā)現(xiàn)鍶離子會(huì)減小晶體的尺寸，改變經(jīng)典羥基磷灰石的針狀結(jié)構(gòu)。XPS、XRD和拉曼光譜能進(jìn)一步證明聚多巴胺仿生摻鍶羥基磷灰石涂層的制備。接觸角測(cè)試說明Ti@PDA+SBF(Sr）組有僅次于Ti@PDA+SBF組的親水性，這可能是由于晶體結(jié)構(gòu)的變化，納米顆粒尺寸減小。

通過細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚多巴胺的修飾可以促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的黏附鋪展，而復(fù)合摻鍶羥基磷灰石涂層后該作用進(jìn)一步增強(qiáng)。材料植入體內(nèi)后直接與細(xì)胞和組織反應(yīng)，良好的細(xì)胞黏附能力和促進(jìn)細(xì)胞增殖能力對(duì)后續(xù)骨整合起到重要意義。

除此之外，聚多巴胺仿生摻鍶羥基磷灰石涂層表面的細(xì)胞與其他組相比有更高的細(xì)胞堿性磷酸酶活性和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。這可能是因?yàn)榫鄱喟桶房梢灾苯佑绊懝钦?，而羥基磷灰石與天然骨骼相似的無(wú)機(jī)成分和優(yōu)秀的生物相容性可促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。低劑量摻入的鍶離子本身也具有促進(jìn)成骨，減少骨吸收的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過簡(jiǎn)單的仿生礦化法，在鈦合金表面結(jié)合聚多巴胺并復(fù)合摻鍶的羥基磷灰石，成功制備一具有良好生物相容性的復(fù)合涂層。通過一系列體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證材料促進(jìn)了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞黏附、增殖和細(xì)胞的成骨分化。證明了該材料對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性的正向調(diào)控作用。