呂武龍 鄧 煒 雷 靂 劉大勇 運新躍 李長義

種植體植入體內(nèi)立刻會引起炎癥反應(yīng)［1］。巨噬細(xì)胞是首先到達種植體表面的一種細(xì)胞，是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過吞噬細(xì)胞殘片，分泌各種酶、細(xì)胞因子，影響傷口愈合和組織再生過程［2,3］。此外，巨噬細(xì)胞具有極大的可塑性，不同種植體表面形貌和/或化學(xué)性質(zhì)可影響巨噬細(xì)胞的極化和細(xì)胞因子的分泌，最終影響種植體的早期骨結(jié)合過程［4,5］。紫外線照射是一種新型種植體表面改性技術(shù)，可提高鈦種植體表面生物活性，促進種植體早期骨結(jié)合［6］。紫外線照射的拋光和TiO2納米管形貌能否影響巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，少有報道。本項研究探討紫外線照射的以上兩種不同表面形貌對巨噬細(xì)胞功能的影響，為該技術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 試件的制備 純鈦試件（直徑為15mm，寶雞鈦業(yè)股份有限公司）經(jīng)碳化硅砂紙拋光至600目備用，即拋光組。參考作者以往的研究［7,8］，采用陽極氧化法在拋光后的純鈦試件表面制備TiO2納米管，0.5%氫氟酸溶液為電解液，鉑片為陰極，實驗采用20V恒電壓，時間為40min，制備出TiO2納米管，即納米管組。為了使試件充分老化，參考Tsukimura等［9］的方法，所有拋光組和納米管組試件經(jīng)高壓滅菌后避光保存8周。各組取一半試件置于紫外燈（30W，λ=253.7nm，飛利浦公司）下10cm處照射48h，照射后立即進行實驗。經(jīng)紫外線照射的拋光組和納米管組試件標(biāo)記為拋光+紫外線組和納米管+紫外線組。

1.2 表面特征分析 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800，日本日立）觀察拋光組和納米管組各1個試件的表面形貌。取以上4組試件各3個，室溫下將1μL超純水滴在試件表面，用接觸角測定儀（JGW-360A，廈門崇達智能科技有限公司）測量接觸角。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 在5%CO2、37℃的條件下，用含青霉素、鏈霉素和10%胎牛血清的高糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）培養(yǎng)RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心），每2-3 天傳代1次。將四組試件放置于24 孔培養(yǎng)板中，以2×104個/孔的細(xì)胞密度將巨噬細(xì)胞接種在不同鈦試件上，并設(shè)置空白對照組。

1.3.1 細(xì)胞黏附和增殖實驗 培養(yǎng)4、24、72h后，用CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測各組試件巨噬細(xì)胞黏附和增殖情況，每組每個時間點3個試件。到達預(yù)定時間后，收集各組培養(yǎng)24和72h的細(xì)胞上清液用于后續(xù)細(xì)胞因子檢測實驗。到達預(yù)定時間后，漂洗試件，并轉(zhuǎn)移到新的24孔培養(yǎng)板中，加1mL含CCK-8的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1h。吸取200μL混合溶液至96孔培養(yǎng)板中，450nm處測定吸光度（OD值）。

1.3.2 細(xì)胞因子檢測 取各組24和72h 的細(xì)胞上清液，按照液相芯片分析技術(shù)（Magnetic Luminex Assay）（LXSAMSM-05，R&D，美國）的說明，檢測腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和巨噬細(xì)胞炎性 蛋 白1α（macrophage inflammatory protein1α，MIP-1α）的質(zhì)量濃度。

1.3.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 每組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)2h后，各取一個試件，經(jīng)3%戊二醛溶液固定、梯度脫水、干燥后噴金，用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對各組試件表面接觸角、相同時間點的細(xì)胞黏附和增殖OD 值、細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度分別進行單因素方差分析，并用SNK 法檢驗組間差別，檢驗水準(zhǔn)設(shè)置為雙側(cè)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 拋光組和納米管組試件表面形貌觀察 較低的放大倍數(shù)下（500 倍），拋光組試件有明顯的打磨痕跡（圖1A），而納米管組試件隱約可見打磨痕跡，表面有直徑約為1-5μm 大小不等的凹坑（圖1B）。較高的放大倍數(shù)下（100000 倍），拋光組試件仍然有明顯劃痕，無明顯納米結(jié)構(gòu)（圖1C），而納米管組試件表面均勻分布直徑約為80nm 的TiO2納米管（圖1D）。

圖1 拋光組和納米管組試件的表面形貌觀察（A，B掃描電鏡放大500倍；C，D掃描電鏡放大100000倍）A，C：拋光組；B，D：納米管組

2.2 各組試件表面接觸角 拋光組、納米管組、拋光+紫外線組和納米管+紫外線組試件表面接觸角分別為77.4°±4.6°、49.5°±6.9°、39.6°±3.8°和0.0°±0.0°，見圖2。拋光+紫外線組和納米管+紫外線組試件表面接觸角明顯小于拋光組和納米管組（P＜0.05），且納米管+紫外線組試件呈超親水性，顯著小于拋光+紫外線組（P＜0.05）。

圖2 試件表面接觸角PT：拋光組；NT：納米管組；PT+UV：拋光+紫外線組；NT+UV：納米管+紫外線組。a表示與拋光組相比P＜0.05；b表示與納米管組相比P＜0.05；c表示與拋光+紫外線組相比P＜0.05

2.3 各組細(xì)胞黏附和增殖（見圖3）培養(yǎng)4 和24h 時各組細(xì)胞吸光值相似，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)72h 時，納米管+紫外線組細(xì)胞增殖顯著高于其他四組（P＜0.05）。

圖3 各組細(xì)胞黏附和增殖情況PT：拋光組；NT：納米管組；PT+UV：拋光+紫外線組；NT+UV：納米管+紫外線組；Ctrl：空白對照組。a表示與拋光組相比P＜0.05；b表示與納米管組相比P＜0.05；c表示與拋光+紫外線組相比P＜0.05；d表示與空白對照組相比P＜0.05

2.4 各組細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度（見表1）培養(yǎng)24h 時，拋光組TNF-α 質(zhì)量濃度明顯高于其他四組（P＜0.05），而各組VEGF 均很低，無顯著性差異（P＞0.05）；培養(yǎng)72h時，拋光+紫外線組和納米管+紫外線組TNF-α 和VEGF 質(zhì)量濃度均分別顯著小于拋光組和納米管組（P＜0.05）。培養(yǎng)24h 時，拋光+紫外線組和納米管+紫外線組MIP-1α 質(zhì)量濃度均低于拋光組（P＜0.05）；培養(yǎng)72h 時拋光組MIP-1α質(zhì)量濃度顯著高于其他四組（P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞形態(tài)觀察（見圖4）培養(yǎng)2h 后，拋光組巨噬細(xì)胞大多呈橢圓形，伸展充分，納米管組更多細(xì)胞呈橢圓形，伸展更充分，長寬比更大，且有大片的板狀偽足；拋光+紫外線組和納米管+紫外線組巨噬細(xì)胞大都呈圓形，拋光+紫外線組細(xì)胞呈球狀，而納米管+紫外線組細(xì)胞更扁。

表1 各組試件細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的比較（ng/L，Mean±SD）

圖4 小鼠巨噬細(xì)胞在4組試件表面培養(yǎng)2h后的細(xì)胞形態(tài)（A，B，C，D掃描電鏡放大500倍；E，F(xiàn)，G，H掃描電鏡4000倍放大）A，E：拋光組；B，F(xiàn)：納米管組；C，G：拋光+紫外線組；D，H：納米管+紫外線組

3.討論

種植體表面特征（如表面形貌、親水性等）是影響種植體早期骨結(jié)合的重要因素［10，11］。種植體表面特征不僅影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，也影響巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌、M1/M2極化的改變，從而最終影響種植體早期骨結(jié)合［4］。本項研究結(jié)果顯示：紫外線照射的TiO2納米管形貌可明顯增加其表面親水性和巨噬細(xì)胞增殖；此外，紫外線照射的兩種種植體形貌均可降低巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌。

本項研究中，充分老化的納米管組試件的接觸角明顯小于拋光組，而納米管+紫外線組試件的接觸角是超親水性的0°，顯著小于拋光+紫外線組（P＜0.05）。該結(jié)果說明紫外線照射和TiO2納米形貌具有協(xié)同作用，顯著增加了該試件表面的親水性。其原因可能有以下兩點：第一，鈦種植體在存儲過程中會不斷吸附碳?xì)浠衔?，降低了親水性，從而影響種植體表面理化性質(zhì)和生物活性［12，13］。TiO2納米管能延緩鈦表面碳?xì)浠衔锏任廴疚锏某练e，因此，經(jīng)過8周充分老化后，納米管組試件的接觸角也比拋光組試件小。第二，TiO2經(jīng)紫外線照射后產(chǎn)生的光催化反應(yīng)能有效清除其表面的碳?xì)浠衔锏任廴疚铮?2，14］。與拋光+紫外線組相比，納米管+紫外線組試件表面的TiO2氧化層更厚，能產(chǎn)生更強的光催化反應(yīng)，更有效清除碳?xì)浠衔?，從而增加了親水性［12，15］。

種植體表面特征能影響細(xì)胞的黏附增殖、分化和局部細(xì)胞因子的分泌［16］。本項研究中，盡管各組試件表面巨噬細(xì)胞最初的黏附情況相似，但72h后納米管+紫外線組細(xì)胞增殖最快。其原因可能是獨特的TiO2納米管形貌經(jīng)紫外線照射后，能有效清除碳?xì)浠衔锏任廴疚铮淖兞嗽嚰砻娴挠H水性和化學(xué)性質(zhì)［15］，從而影響了蛋白質(zhì)的吸附、細(xì)胞的黏附增殖［2，5］。

盡管拋光組和拋光+紫外線組的細(xì)胞黏附增殖沒有差異，但是拋光+紫外線組巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子比拋光組少，甚至比納米管組少，說明紫外線照射的兩種形貌表面親水性和化學(xué)性質(zhì)的變化均有利于減少巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的分泌。巨噬細(xì)胞具有極大的可塑性，不同種植體表面形貌和/或化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生的不同微環(huán)境能改變其表型和功能［16，17］。本項研究中，紫外線照射的兩種形貌均能減少巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、MIP-1α和VEFG。研究顯示，親水性形貌可減少巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的分泌，與本項研究結(jié)果一致［2，5，18，19］。通常認(rèn)為，最初的炎癥反應(yīng)是成功骨結(jié)合的必要條件，而持續(xù)過度的炎癥反應(yīng)則不利于骨結(jié)合形成。如短暫、低水平的TNF-α可促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸募和成骨分化，而持續(xù)高水平的TNF-α對骨愈合有不利影響［20］。MIP-1α具有單核細(xì)胞趨化作用，能募集淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞到種植部位，從而促進了炎癥反應(yīng)［20］。VEGF的分泌是組織修復(fù)過程中血管形成的必要條件，而Spiller等發(fā)現(xiàn)，主要是M1型巨噬細(xì)胞而非M2型巨噬細(xì)胞分泌VEGF［21］。本項研究結(jié)果提示紫外線照射的兩種形貌均能減少巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可能改變了巨噬細(xì)胞極化，這可能是紫外線照射能促進種植體早期骨結(jié)合的部分原因。

本項研究結(jié)果顯示，納米管+紫外線組和拋光+紫外線組試件表面的巨噬細(xì)胞最初的形態(tài)呈圓形，與未照射組巨噬細(xì)胞形態(tài)有很大差異。這與紫外線照射改變了兩種形貌試件表面親水性和化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。作者在實驗時注意到，將細(xì)胞懸液接種到納米管+紫外線組和拋光+紫外線組試件表面時，細(xì)胞懸液迅速向四周鋪展。紫外線照射導(dǎo)致的試件各向同性可能也是巨噬細(xì)胞向四周鋪展，呈圓形的原因。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)可調(diào)控巨噬細(xì)胞表型和功能，導(dǎo)致分泌的細(xì)胞因子有差異［22］。而紫外線照射鈦種植體表面導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能的改變，其分子機制還有待于進一步研究。

4.結(jié)論

紫外線照射是一種簡單有效的種植體表面改性技術(shù)。紫外線照射能增加兩種鈦表面形貌尤其是TiO2納米管形貌的親水性。紫外線照射的TiO2納米管形貌能促進巨噬細(xì)胞增殖；紫外線照射的種植體表面形貌能減輕炎癥反應(yīng)。