程 濤，張 生，姚 遠(yuǎn)，張向?qū)帲瑥垚圯x，侯崇智

西安市兒童醫(yī)院普外一科，陜西 西安 710002

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見的實體腫瘤。由于現(xiàn)有針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療方法對于高風(fēng)險神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的治愈率只有30%。因此，高風(fēng)險的神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童主要的腫瘤相關(guān)致死原因［1-3］。神經(jīng)母細(xì)胞瘤起源于神經(jīng)嵴，通常易發(fā)于腎上腺髓質(zhì)或椎旁神經(jīng)結(jié)，以頸部、胸部、腹部和骨盆腫塊為特征。然而，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)高度不一致，可僅表現(xiàn)為腫塊而無癥狀，也可由于局部浸潤或廣泛轉(zhuǎn)移而造成不良預(yù)后［4］。因此，對神經(jīng)母細(xì)胞瘤病理發(fā)生和分子機(jī)制的進(jìn)一步研究可以幫助我們發(fā)現(xiàn)新的治療策略從而有效控制神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

microRNA（miRNA）是內(nèi)源表達(dá)的小型非編碼RNA，大量研究表明miRNA 在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用［5-6］。miR?449a 在許多腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能，包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、前列腺癌等［7-9］。近期，有文獻(xiàn)報道m(xù)iR?449a 可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化和細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤［10］。但是miR?449a 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中是否存在其他作用機(jī)制仍不清楚。

MDM2 和MDM4 含有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，都包含1 個鋅指結(jié)構(gòu)域、1個與p53 N 端相連的N端結(jié)構(gòu)域以及C 端的RING（really interesting new gene）結(jié)構(gòu)域。MDM2 和MDM4 均被報道對p53 發(fā)揮抑制作用。MDM2 的作用機(jī)制已被廣泛研究，主要是通過與p53直接結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄因子活性及促進(jìn)p53的泛素化降解。MDM4主要是通過調(diào)節(jié)p53的活性發(fā)揮作用，協(xié)同MDM2發(fā)揮其泛素蛋白酶活性［11］。文獻(xiàn)報道MDM4在早期胚胎發(fā)育過程中可以負(fù)向調(diào)控由p53 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12］，然而MDM4在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用機(jī)制仍有待探索。本研究分析了miR?449a 對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響，并評價了miR?449a 對腫瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡和相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株BE（2）?C購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco 公司，美國）；青霉素和胰酶、BeyoRTTM2 cD?NA 第一鏈合成試劑盒、PMSF、BCA 蛋白定量試劑盒、CCK?8 試劑盒、Annexin V?FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色液（上海碧云天公司）；miR?449a模擬物、抑制物和p53干擾質(zhì)粒（上海吉瑪生物有限公司）。TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa 公司，日本）；熒光素酶活性檢測試劑盒（Promega 公司，美國）；所有抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株BE（2）?C 培養(yǎng)基為DMEM加10%胎牛血清，1%青霉素和胰酶。細(xì)胞置于含5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液每2 d更換1次。所有實驗都采用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qPCR）

用TRIzol 試劑提取總RNA 并使用廣譜分析儀確定RNA 質(zhì)量，隨后使用cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green PCR Mas?ter Mix 和應(yīng)用生物系統(tǒng)7500 實時PCR 系統(tǒng)進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)，PCR 引物通過Premier3.0 軟件進(jìn)行設(shè)計并通過上海生工合成。引物序列為：MDM4，上游5′?AGGTCCAGCCTAGATGTTTC?3′，下游5′?AGGTCCAGCCTAGATGTTTC?3′；β?actin，上游5′?CCTGGCACCCAGCACAAT?3′，下游5′?GGGCCG?GACTCGTCATAC?3′。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，45 s，40個循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s?；蛳鄬Ρ磉_(dá)水平根據(jù)公式2-ΔCT進(jìn)行計算。

1.2.3 CCK?8試驗

于實驗前日接種細(xì)胞3 000 個/孔（對照組和轉(zhuǎn)染miR?449a模擬物組）于96孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜（37 ℃、5%CO2）。培養(yǎng)次日，去除培養(yǎng)液并向培養(yǎng)板中加入100 μL CCK?8檢測溶液（包含90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK?8），培養(yǎng)1 h。隨后測定450 nm處吸光度值。

1.2.4 克隆形成試驗

接種3 000 個處理后的細(xì)胞（對照組和轉(zhuǎn)染miR?449a 模擬物組）于6 孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3周，每3 d更換1次培養(yǎng)液。3周后將培養(yǎng)液吸出加入4%多聚甲醛固定15 min。然后去除固定液，加適量考馬斯亮藍(lán)染液染色20 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后拍照、計數(shù)。

1.2.5 熒光素酶活性分析

根據(jù)預(yù)測結(jié)果，分別將野生型和突變型MDM4基因的3′UTR區(qū)域克隆到pGL3載體中，并將載體和miR449a的模擬物一同轉(zhuǎn)染至BE（2）?C細(xì)胞中。熒光素酶活性檢測利用熒光素酶活性檢測試劑盒來完成。轉(zhuǎn)染48 h 后，吸取培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 次。6 孔板每孔加入260 μL 裂解液并用刮子將細(xì)胞收集到1.5 mL 離心管中，12 000 r/min，4 ℃離心15 min后收集上清。將100 μL細(xì)胞裂解液加到96孔板中，然后每孔加入100 μL底物，迅速混勻后在發(fā)光儀上讀取數(shù)值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將處理后的細(xì)胞（對照組、轉(zhuǎn)染MDM4 過表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染miR?449a 模擬物組、同時轉(zhuǎn)染MDM4過表達(dá)質(zhì)粒和miR?449a模擬物組）用不含EDTA 的胰酶消化收集后，室溫條件下，2 000 r/min 離心5～10 min，收集細(xì)胞。用預(yù)冷1×PBS（4 ℃）重懸細(xì)胞1 次，2 000 r/min 離心5～10 min，洗滌細(xì)胞；加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V?FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；上機(jī)前5 min 再加入5 μL PI 染色；上機(jī)前，補(bǔ)加200 μL 1×Binding Buffer。流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 免疫印跡實驗

總細(xì)胞蛋白通過標(biāo)準(zhǔn)流程提取和定量。BE（2）?C細(xì)胞加入添加了蛋白酶抑制劑和PMSF 的RIPA 試劑，置于冰上30 min，13 000g4 ℃離心15 min 后收集上清。采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白加入SDS?PAGE 膠并將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將膜置于5%脫脂奶粉溶液于室溫孵育2 h。隨后4 ℃孵育一抗MDM4（1∶1 000）、MDM2（1∶1 000）、p53（1∶1 000）、cleaved PARP（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）過夜。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?449a 過表達(dá)抑制BE（2）?C 細(xì)胞增殖和克隆形成

將miR?449a模擬物轉(zhuǎn)染到BE（2）?C細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞qPCR檢測miR?449a表達(dá)量。由圖1A可見，轉(zhuǎn)染miR?449a模擬物后，miR?449a表達(dá)量顯著升高，說明miR?449a模擬物達(dá)到了過表達(dá)miR?449a的目的。隨后發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR?449a會顯著抑制BE（2）?C細(xì)胞增殖（圖1B），降低細(xì)胞克隆形成能力，對照組克隆數(shù)目為（684±25）個，而轉(zhuǎn)染miR?449a模擬物組克隆數(shù)目為（114±23）個（圖1C、D）。

2.2 MDM4是miR?449a的靶基因

圖1 miR?449a過表達(dá)抑制BE（2）?C細(xì)胞增殖和克隆形成Figure 1 miR?449a overexpression inhibits cell proliferation and colony formation in BE（2）?C cell line

為了研究miR?449a的作用機(jī)制，運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫miRDB 預(yù)測miR?449a 的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在評分為100 的預(yù)測靶基因中，存在1 個p53 調(diào)節(jié)基因MDM4。于是運(yùn)用熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)驗證MDM4是否為miR?449a 的靶基因。如圖2A 和2B 所示，將包含2個預(yù)測位點(diǎn)的MDM4野生型（MDM4?WT）3′UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3 中，并同時構(gòu)建針對2 個位點(diǎn)的突變型（MDM4?mut1、MDM4?mut2、MDM4?mut1?2）質(zhì)粒。熒光素酶結(jié)果顯示，與空載組相比，miR?449a 過表達(dá)顯著降低轉(zhuǎn)染了MDM4野生型和突變型質(zhì)粒組的熒光素酶活性。另外，與轉(zhuǎn)染MDM4野生型質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染MDM4突變質(zhì)粒后熒光素酶活性顯著升高（圖2C）。接下來將miR?449a 的模擬物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，檢測MDM4 mRNA 和蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?449a 后MDM4 的表達(dá)水平均降低（圖2D、E）。因此可以得出結(jié)論，MDM4是miR?449a的1個靶基因。

2.3 干擾MDM4 表達(dá)可以顯著降低BE（2）?C 細(xì)胞增殖和克隆形成能力

為了研究miR?449a 的靶基因MDM4 對于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用，從而進(jìn)一步闡明miR?449a的作用機(jī)制，本研究合成MDM4 的siRNA 并將siMDM4 和miR?449a模擬物分別或同時轉(zhuǎn)染BE（2）?C細(xì)胞。

通過CCK?8法檢測了細(xì)胞24、48及72 h的增殖情況。如圖3A所示，siMDM4和miR?449a模擬物均可顯著抑制BE（2）?C細(xì)胞增殖，并且siMDM4和miR?449a模擬物對于BE（2）?C細(xì)胞增殖抑制效果近似，同時轉(zhuǎn)染miR?449a 和siMDM4 沒有表現(xiàn)出疊加效應(yīng)。該結(jié)果進(jìn)一步表明，miR?449a 通過調(diào)控MDM4從而抑制BE（2）?C細(xì)胞增殖。

圖2 MDM4是miR?449a的靶基因Figure 2 MDM4 is a target gene of miR?449a

克隆形成試驗結(jié)果顯示，siMDM4 和miR?449a模擬物均可顯著抑制BE（2）?C 細(xì)胞克隆形成，并且siMDM4 和miR?449a 模擬物抑制效果近似；同時轉(zhuǎn)染miR?449a和siMDM4組克隆形成能力與分別轉(zhuǎn)染siMDM4 或miR?449a 模擬物沒有顯著差別（圖3B、C）。上述結(jié)果表明，miR?449a通過調(diào)控MDM4從而抑制BE（2）?C細(xì)胞增殖和克隆形成。

2.4 過表達(dá)MDM4 可以抵消由轉(zhuǎn)染miR?449a 模擬物所引起的細(xì)胞凋亡和p53蛋白量的增加

圖3 干擾MDM4表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和克隆形成Figure 3 Silencing of MDM4 inhibits cell proliferation and colony formation in BE（2）?C cell line

為了進(jìn)一步驗證上述結(jié)論，單獨(dú)或共同轉(zhuǎn)染miR?449a模擬物和MDM4過表達(dá)質(zhì)粒后，觀察細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)染MDM4過表達(dá)質(zhì)粒會增加細(xì)胞增殖能力，單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR?449a可以降低細(xì)胞增殖能力，但是同時轉(zhuǎn)染miR?449a 和MDM4 會對由轉(zhuǎn)染miR?449a 導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力的降低起到一定的恢復(fù)作用（圖4A）。此外，在轉(zhuǎn)染miR?449a 模擬物的細(xì)胞中高表達(dá)MDM4 可以抵消由轉(zhuǎn)染miR?449a 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增加（細(xì)胞凋亡率為：對照組2.63%±1.02%，MDM4 組1.70%±0.50%，miR?449a 組36.10%±1.68%，MDM4+miR?449a 組6.13%±0.90%）以及p53蛋白水平的上升（圖4B～D）。

接下來檢測了p53 的mRNA 水平的變化，并且觀察到單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR?449a并不影響p53 mRNA水平（圖4E）。該結(jié)果提示miR?449a 應(yīng)該是通過調(diào)控MDM4進(jìn)而對p53的蛋白水平進(jìn)行調(diào)控。如圖4F所示，過表達(dá)MDM4可以降低p53蛋白水平，但是蛋白酶體抑制劑MG132 處理可以部分阻止p53 的降解。因此我們認(rèn)為MDM4 通過調(diào)控p53蛋白的穩(wěn)定性而非mRNA水平發(fā)揮作用。

2.5 miR?449a 通過調(diào)控MDM4 穩(wěn)定p53 蛋白水平從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡

圖4 過表達(dá)MDM4可以抵消由轉(zhuǎn)染miR?449a所引起的細(xì)胞凋亡和p53蛋白量的增加Figure 4 Overexpression MDM4 blocks the increase of cell apoptosis and the protein level of p53 induced by miR?449a transfection

為了進(jìn)一步闡明miR?449a 抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的分子機(jī)制，我們將miR?449a 模擬物轉(zhuǎn)染BE（2）?C 細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，通過免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化。如圖5A、B 所示，miR?449a 顯著增加BE（2）?C 細(xì)胞凋亡，凋亡率由（3.00±1.32）%增加至（38.20±2.78）%。miR?449a 顯著下調(diào)MDM4 蛋白水平并上調(diào)p53 蛋白水平。p53上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡分子cleaved PARP 上調(diào)（圖5C）。為了進(jìn)一步證明p53在此中的作用，我們構(gòu)建p53 低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株［shp53 BE（2）?C］并用此細(xì)胞株進(jìn)行上述實驗，結(jié)果證明在shp53 BE（2）?C 細(xì)胞中miR?449a 不能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，凋亡率由（3.33±1.20）%增加至（4.26±0.55）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外發(fā)現(xiàn)miR?449a 并不能影響MDM2 的蛋白水平。因此，miR?449a可能通過調(diào)控MDM4穩(wěn)定p53蛋白水平從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

3 討論

已有研究表明，miR?449a作為腫瘤抑制子在多種腫瘤中阻止腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，包括肺癌、前列腺癌、胃癌及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤［7-8，13-14］。除了對腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)控，miR?449a也可通過其他機(jī)制對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，如抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中miR?449a 也可通過引起細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞增殖發(fā)揮腫瘤抑制作用。

圖5 miR?449a抑制MDM4并促進(jìn)p53蛋白穩(wěn)定Figure 5 miR?449a inhibits the level of MDM4 and promotes stability of p53

本文主要研究了miR?449a 靶基因其中之一的MDM4。首先通過經(jīng)典的miRNA 靶基因預(yù)測方法預(yù)測miR?449a 潛在靶基因。該方法基于種子區(qū)域（通常位于miRNA 5′端的6～8個核苷酸）與mRNA 3′UTR 靶向區(qū)的相互作用［15］。進(jìn)而我們通過熒光素酶實驗證明MDM4 確實為miR?449a 的1 個靶基因。據(jù)報道，MDM4 是p53 的負(fù)調(diào)控因子，但是由于MDM4 沒有泛素酶活性，需要與MDM2 結(jié)合形成2聚體，進(jìn)而促進(jìn)MDM2 對p53 泛素化［16］。另外在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了MDM4的過表達(dá)。MDM4可以通過抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生［17］。本研究發(fā)現(xiàn)miR?449a 可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡和p53 的表達(dá)，但是在高表達(dá)MDM4 的細(xì)胞中這種效應(yīng)得到了中和。另外，我們還發(fā)現(xiàn)miR?449a對MDM2的表達(dá)沒有影響，進(jìn)而證明miR?449a 通過調(diào)控MDM4 穩(wěn)定p53 蛋白。然而，其他miR?449a 可能的靶基因可能同樣對于細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用，后續(xù)我們依然需要研究這些靶基因的作用從而完整地闡明miR?449a 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中抑制腫瘤的機(jī)制。

囿于資源局限性，無法在本研究中檢測miR?449a在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者樣本中的內(nèi)源表達(dá)水平，從而闡釋miR?449a 表達(dá)水平與腫瘤患者生存時間的關(guān)系。對于miR?449a 內(nèi)源表達(dá)水平調(diào)控機(jī)制的研究將進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療策略的發(fā)展。