王 燕，田 薇，章建國(guó)，劉益飛，靳 欽

南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226001

膠質(zhì)瘤是目前最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性腦腫瘤［1］，盡管近年來(lái)針對(duì)膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療方法取得了一定程度的進(jìn)展，但患者的預(yù)后仍然不理想［2］。Gemi?nin作為一種小分子蛋白，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可高表達(dá)于多種惡性腫瘤，發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖分化的作用［3］，但其在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色以及具體的作用機(jī)制目前還不清楚。本研究旨在通過(guò)基因沉默技術(shù)利用siRNA敲除Geminin 在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 中的表達(dá)，探究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、增殖、遷移和侵襲的影響，初步探索可能的發(fā)生機(jī)制，為明確其是否可以作為膠質(zhì)瘤治療的新作用靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018—2019 年南通大學(xué)附屬醫(yī)院20 例患者（男12 例，女8 例；年齡27～74 歲，平均年齡51.5歲，中位年齡48 歲）術(shù)后新鮮腦膠質(zhì)瘤組織和瘤旁正常腦組織的標(biāo)本，所有參與實(shí)驗(yàn)的患者術(shù)前均未接受任何放化療等抗腫瘤治療，其臨床病理資料和隨訪記錄均完整。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，知情同意書(shū)齊全，均由患者或其家屬簽署。人膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；qRT?PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Cell Counting Kit?8（CCK?8）試劑盒購(gòu)自上海BestBio 公司；抗HBO1、Cdt1、GAPDH 抗體及二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；siRNA 片段購(gòu)自上海晶賽公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)及qRT?PCR分析Geminin在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

為了獲得Geminin 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式，我們利用來(lái)自基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer?pku.cn/）的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。另外使用qRT?PCR 方法檢測(cè)20 例人新鮮膠質(zhì)瘤組織中Geminin 的表達(dá)情況，具體方法如下：TRIzol 提取膠質(zhì)瘤組織中的總RNA，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT?PCR 試劑盒說(shuō)明操作，Geminin 特異性引物序列：（上游）5′?AGAAAATGAGCTGTCCGCAGG?3′；（下游）5′?TACAGCGCCTTTCTCCGTTT?3′，產(chǎn)物大小213 bp；以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，其特異性引物序列：（上游）5′?GAAGGTCGGAGTCAACGGAT?3′；（下游）5′?TCCCGTTCTCAGCCATGTAGTT?3′，產(chǎn)物大小131 bp。PCR 擴(kuò)增通過(guò)以下條件進(jìn)行，95 ℃5 min，然后95 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。最終結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中用含有10% FBS、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。Geminin 特異性siRNA 序列為：（上游）5′?GGUCCUGAAGCCAAUGAAA?3′，（下游）5′?UUUCAUUGGUTTUAGGAUU?3′；陰性siRNA 序列為：（上游）5′?CGGCT?TCGCGGGCGACGGA?3′，（下游）5′?GAGGAGCTGGAAGCAGCCG?3′；后續(xù)實(shí)驗(yàn)共設(shè)置有3 組：空白對(duì)照組（Control）、陰性對(duì)照組（si?NC）和干擾組（si?Geminin）。當(dāng)U251細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)約50%時(shí)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法（參照說(shuō)明書(shū)），將Geminin 特異性siRNA 序列及陰性序列分別轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，然后用qPCR法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率。

1.2.3 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

siRNA 轉(zhuǎn)染24 h 后，將細(xì)胞消化，然后在96 孔板中以1×104個(gè)/孔的密度在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h通過(guò)CCK?8試劑盒測(cè)量細(xì)胞活性，每次檢測(cè)之前，將CCK?8 試劑加入板中后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h。最后測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下分析光密度，并繪制細(xì)胞增殖曲線。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移情況

利用Transwell 小室測(cè)定U251 細(xì)胞的侵襲與遷移能力。將熔融過(guò)夜的100 μL Matrigel 添加到24孔板的Transwell 小室上室中，均勻搖晃，并置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中4～6 h，以形成凝膠。然后將500 μL 無(wú)血清培養(yǎng)液加入到下室中，并且將底物膜水合30 min。將轉(zhuǎn)染后48 h的U251 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度轉(zhuǎn)接至涂有基質(zhì)的Transwell 上室中，將500 μL 全培養(yǎng)液加入下腔室中，過(guò)夜后，移開(kāi)小腔室，并用棉簽擦拭上腔室中剩余的細(xì)胞。PBS 清洗后，4%多聚甲醛固定30 min；0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS 清洗，在顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，采用Transwell 腔室代替基質(zhì)涂層腔室，進(jìn)行細(xì)胞遷移能力測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)干擾后Geminin、HBO1、Cdt1的蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集3組細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明操作，裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白濃度；然后將總蛋白20 μg 樣品加到12%分離凝膠上并轉(zhuǎn)膜；TBST洗滌5 min，室溫下5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h；TBST洗滌后，4 ℃下孵抗Geminin（1∶200）、抗HBO1（1∶200）和抗Cdt1（1∶200）一抗過(guò)夜；TBST 洗滌后，室溫下將膜孵HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000）2 h。最后ECL顯色，LabWorks 灰度圖像分析軟件分析。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0和Graphpad 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Geminin在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)情況

從GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的結(jié)果表明，無(wú)論是低級(jí)別膠質(zhì)瘤還是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中Geminin 的表達(dá)均明顯高于瘤旁正常腦組織（圖1A、B，P＜0.05）。同時(shí)本課題組利用qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)方法得出的結(jié)果顯示，20 例新鮮膠質(zhì)瘤組織中Geminin mRNA 的表達(dá)（1.30±0.22）明顯高于瘤旁正常腦組織（0.88±0.19），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C）。

圖1 膠質(zhì)瘤組織中Geminin的表達(dá)水平增高Figure 1 High expression of Geminin in glioma tissues

2.2 Geminin基因沉默

qRT?PCR 檢測(cè)基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞內(nèi)Gemi?nin 基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與Control 組（1.01±0.18）及si?NC 組（0.96±0.08）相比，si?Geminin 組（0.18±0.05）中Geminin mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，圖2）。

2.3 Geminin基因沉默對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

CCK?8 法檢測(cè)Geminin 基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞的增殖的影響，結(jié)果顯示，與Control 組及si?NC 組相比，si?Geminin 組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05，圖3）。

2.4 Geminin 基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si?Geminin 組U251 細(xì)胞遷移數(shù)量［（70.33±5.51）個(gè)/視野］和侵襲數(shù)量［（29.00±3.61）個(gè)/視野］與Control 組［遷移（146.33±13.20）個(gè)/視野；侵襲（81.67±5.13）個(gè)/視野］及si?NC組［遷移（144.00±5.57）個(gè)/視野；侵襲（86.67±7.68）個(gè)/視野］相比均顯著降低（均P＜0.05，圖4）。

圖2 Geminin 基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞Geminin mRNA 表達(dá)水平的影響Figure 2 Effect of Geminin gene silencing on Geminin mRNA expression in U251 cells

2.5 Geminin 基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞內(nèi)HBO1、Cdt1蛋白表達(dá)的影響

圖3 Geminin基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of Geminin gene silencing on U251 cell proliferation

Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Geminin 基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞內(nèi)Geminin、HBO1、Cdt1 蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與Control組及si?NC組相比，si?Gem?inin 組U251 細(xì) 胞 內(nèi)Geminin（0.36±0.03）、HBO1（0.39±0.02）、Cdt1蛋白（0.31±0.04）表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05，圖5）。

3 討論

圖4 Geminin基因沉默對(duì)U251細(xì)胞遷移和侵襲的影響（×400）Figure 4 Effect of Geminin gene silencing on U251 cell migration and invasion（×400）

圖5 Geminin基因沉默對(duì)U251 細(xì)胞內(nèi)HBO1、Cdt1蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of Geminin gene silencing on protein expressions of HBO1，Cdt1 in U251 cells

膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，占成人惡性腦腫瘤的70%以上［1］，具有高度惡性及高病死率的特點(diǎn)，患者預(yù)后不良［4］。目前對(duì)該腫瘤患者的治療臨床上仍然采用外科手術(shù)治療與術(shù)后放療化療相結(jié)合的方法，此方法對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療存在一定的缺陷［5］：首先，因膠質(zhì)瘤腫瘤本身的特點(diǎn)及生長(zhǎng)部位的特殊性外科手術(shù)不能完全切除；其次，因?yàn)檠X屏障的存在，該腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療不敏感。因此不能完全根治，而且容易復(fù)發(fā)。有研究表明，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與基因突變引起神經(jīng)干細(xì)胞分化失調(diào)存在一定的相關(guān)性［6］，鑒于此，用于膠質(zhì)瘤早期發(fā)現(xiàn)與治療的一系列生物標(biāo)志物正在深入研究中［7］。目前雖然用于膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)［8?9］（如血管生成擬態(tài)、腎母細(xì)胞瘤Ⅰ基因產(chǎn)物、miR?128）及新興的靶向性藥物［10］、抗PD?1/PD?L1［11］及CAR?T 治療［12］等已初見(jiàn)成效，但并未獲得突破性進(jìn)展。因此尋找新的、行之有效的分子靶點(diǎn)勢(shì)在必行。

Geminin 由McGarry 和Kirschner［13］首次發(fā)現(xiàn)，是一種小分子多功能的核蛋白，主要在細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用［14］。Geminin 在許多不同類(lèi)型的腫瘤中高表達(dá)，如消化系統(tǒng)腫瘤（胃癌、腸癌等）、口腔惡性黑色素瘤、乳腺癌及肺癌等［15］，其高表達(dá)常預(yù)示腫瘤細(xì)胞侵襲性高，提示腫瘤患者不良預(yù)后［16-17］。除了在保持基因組保真度方面發(fā)揮作用外，Geminin 對(duì)于胚胎發(fā)育的多個(gè)方面也是必需的，并且可以通過(guò)與染色質(zhì)調(diào)節(jié)復(fù)合物的相互作用來(lái)控制胚胎基因的表達(dá)［18-19］，可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)組織的生成［20］。研究發(fā)現(xiàn)，Geminin作為DNA復(fù)制的拮抗劑和調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)整神經(jīng)干細(xì)胞和室管膜細(xì)胞的比例進(jìn)而可能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展產(chǎn)生影響［21］。因此，本課題組通過(guò)基因沉默技術(shù)研究其在膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)模式以及對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響和可能發(fā)生的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，Geminin 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增高，轉(zhuǎn)染siRNA后膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中Geminin mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞的增殖能力降低，細(xì)胞的遷移和侵襲的數(shù)量減少，由此可以推斷，Geminin 的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度密切相關(guān)。

Cdt1是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系［22］。在細(xì)胞周期中，Cdt1對(duì)于將DNA 解旋酶加載到DNA 復(fù)制起點(diǎn)上至關(guān)重要，并受Geminin的調(diào)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)，Geminin通過(guò)控制細(xì)胞周期內(nèi)DNA 復(fù)制的重新啟動(dòng)來(lái)維持基因組保真度［14］，Geminin 可雙重調(diào)控Cdt1，在細(xì)胞周期中特異性結(jié)合Cdt1 構(gòu)成了控制Cdt1 活性的第3 個(gè)系統(tǒng)，既可以防止Cdt1 重新啟動(dòng)DNA 復(fù)制（S/G2 階段，負(fù)向調(diào)控），又可以保護(hù)Cdt1免受蛋白水解降解（G2/M 階段，正向調(diào)控）［23-24］。而HBO1 可直接與Cdt1相互作用，作為Cdt1的募集輔助因子直接參與了RC前的形成，增強(qiáng)Cdt1依賴的DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。HBO1 最初被鑒定為起源識(shí)別復(fù)合物（ORC）的伴侶，其中包含1 個(gè)保守的MYST 域，該域可乙?；M蛋白并調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞周期中，HBO1通過(guò)兩種方式調(diào)節(jié)DNA復(fù)制，其一是乙?；疕4K5/8/12，促進(jìn)復(fù)制前復(fù)合物（Pre?RC）的形成；其二是乙酰化H3K14，促進(jìn)CDC45的加載，激活S期DNA 的復(fù)制［25］。有研究顯示，HBO1、MOZ 和ORF HAT 復(fù)合物的靶向亞基ING5 的異位表達(dá)可增加Oct4、Olig2 和Nestin 等神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的自我更新，防止譜系分化［26］。近期研究結(jié)果顯示，HBO1在膀胱癌中的高表達(dá)可通過(guò)增強(qiáng)β?catenin在膀胱癌細(xì)胞中的核易位以及上調(diào)β?catenin下游靶基因如c?myc、c?Jun、CCND1、CTLA4、LEF1、TCF1 和Axin2 等的表達(dá)，影響膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［27］。而Geminin在細(xì)胞周期中對(duì)HBO1、Cdt1 不平衡的調(diào)節(jié)作用可能導(dǎo)致DNA 復(fù)制缺陷和基因組的不穩(wěn)定，從而影響細(xì)胞的正常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［28］。但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Geminin對(duì)HBO1、Cdt1的作用尚未有研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因沉默技術(shù)敲除Geminin后檢測(cè)U251 細(xì)胞中HBO1、Cdt1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Geminin 沉默后Geminin、HBO1 及Cdt1 蛋白的表達(dá)水平均降低，由此我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Gemi?nin的高表達(dá)可能影響HBO1、Cdt1的表達(dá)及相互作用，促進(jìn)DNA復(fù)制，進(jìn)而增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。有研究報(bào)道，Geminin 蛋白可通過(guò)影響Wnt信號(hào)通路和上皮型鈣黏蛋白的表達(dá)對(duì)上皮細(xì)胞間質(zhì)化進(jìn)行影響［29］。在腦膠質(zhì)瘤中，Geminin對(duì)HBO1、Cdt1二者的影響是否與此通路相關(guān)，其中是否還有其他的作用機(jī)制尚不清楚，有待于今后進(jìn)一步的研究和探索。