鐘勇 賀珊珊 陳玉梅

膿毒癥指燒傷、感染等引發(fā)的一種全身性炎性反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、感染性休克等造成患者死亡[1,2]。膿毒癥發(fā)生時(shí)炎性因子及炎性介質(zhì)的大量釋放導(dǎo)致促炎因子、抗炎因子失衡從而造成機(jī)體免疫功能損傷[3]。因而如何降低炎性反應(yīng)成為研究重點(diǎn)。研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并可作為診斷膿毒癥的潛在生物標(biāo)志物[4]。研究表明微小RNA-365(microRNA-365，miR-365)表達(dá)降低與膿毒癥患者炎性因子釋放量增加有關(guān)[5]。但miR-365在膿毒癥發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。starBase預(yù)測顯示白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)可能是miR-365的靶基因，研究表明脂多糖誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞中IRAK1高表達(dá)并可促進(jìn)炎性反應(yīng)造成細(xì)胞損傷[6]。但miR-365是否通過調(diào)控IRAK1的表達(dá)從而參與膿毒癥發(fā)生過程尚未可知。本研究采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)[7]，觀察miR-365對(duì)脂多糖(lipopolysacharide，LPS)誘導(dǎo)的HUVECs炎性因子及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，并分析其對(duì)IRAK1的調(diào)控作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購自美國ATCC公司；LPS購自美國eBioscience公司；EGM-2培養(yǎng)基購自北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；miR-365模擬物(mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-con)、miR-365特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-365)及陰性對(duì)照(anti-miR-con)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京百奧萊博科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:HUVECs培養(yǎng)于EGM-2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2，每2天更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞傳代培養(yǎng)，選用第5代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用DMEM培養(yǎng)基(10%)與90%胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞凍存。實(shí)驗(yàn)分組：空白組(未進(jìn)行任何處理的HUVECs)、LPS組(使用濃度為10 μg/ml的LPS處理HUVECs 48 h)[8]、LPS+miR-con組(HUVECs中轉(zhuǎn)染miR-con 48 h，使用濃度為10 μg/ml的LPS處理HUVECs 48 h)、LPS+ miR-365組(HUVECs中轉(zhuǎn)染miR-365 48 h，使用濃度為10 μg/ml的LPS處理HUVECs 48 h)、LPS+ miR-365+pcDNA組(HUVECs中共轉(zhuǎn)染miR-365 mimics、pcDNA 48 h，使用濃度為10 μg/ml的LPS處理HUVECs 48 h)、LPS+ miR-365+pcDNA-IRAK1組(HUVECs中共轉(zhuǎn)染miR-365 mimics、pcDNA-IRAK1 48 h，使用濃度為10 μg/ml的LPS處理HUVECs 48 h)。

1.2.2 檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平:收集6組細(xì)胞培養(yǎng)液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細(xì)胞中miR-365、IRAK1 mRNA表達(dá)水平:采用Trizol法提取HUVECs總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到cDNA，miR-365正向引物為5’-TAATGCCCCTAAAAATCCTTAT-3’，反向引物為5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6正向引物為5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，反向引物為5’-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3’；IRAK1正向引物為5’-TGAAGAGGCTGAAGGAGAA-3’，反向引物為5’-CGTACACCAGGCAGTAGAAG-3’；β-actin正向引物為5’-AGCCTTCCTTCCTGGGCATGG-3’，反向引物為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAGGTC-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)試劑盒說明書配置qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環(huán)40次。置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測，miR-365以U6為內(nèi)參，IRAK1 以β-actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-365、IRAK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長期HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/ml，每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，按照“1.2.1”分組處理，每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μl，置于微量振蕩器中振蕩10 min，置于酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處光密度值(OD)，細(xì)胞存活率(%)=(各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:收集6組HUVECs，PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，4℃條件下經(jīng)10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，加入1 ml結(jié)合緩沖液，4℃條件下經(jīng)10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，加入200 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl Annexin V-FITC與PI，充分混勻，室溫避光孵育20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液置于流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測:starBase預(yù)測顯示miR-365與IRAK1的3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的IRAK1的3’UTR片段插入熒光素酶報(bào)告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-IRAK1與突變型載體MUT-IRAK1，分別將WT-IRAK1、MUT-IRAK1與miR-365 mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染至HUVECs，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.7 蛋白免疫印跡(western blot)檢測IRAK1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá):取6組HUVECs，加入蛋白裂解液提取蛋白，測定蛋白濃度，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白，將其移至PDVF膜，脫脂牛奶(5%)封閉，分別添加IRAK1、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9一抗(1∶500)，4℃孵育24 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，采用Quantity One軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)HUVECs對(duì)miR-365和IRAK1表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS組HUVECs中miR-365的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，IRAK1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見表1,圖1。

表1 LPS誘導(dǎo)HUVECs對(duì)miR-365和IRAK1表達(dá)的影響

圖1 Western blot檢測HUVECs中IRAK1蛋白表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染miR-365抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活 與空白組比較，LPS組HUVECs存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)；與LPS+miR-con組比較，LPS+ miR-365組HUVECs存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。見圖2,表2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和western blot檢測Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

表2 轉(zhuǎn)染miR-365抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活

2.3 轉(zhuǎn)染miR-365抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與LPS+miR-con組比較，LPS+ miR-365組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-365抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌

2.4 miR-365靶向調(diào)控IRAK1表達(dá) starBase預(yù)測顯示miR-365與IRAK1存在靶向序列。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-IRAK1的細(xì)胞中，與miR-con組比較，miR-365組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-IRAK1的細(xì)胞中，與miR-con組比較，miR-365組熒光素酶活性無明顯變化。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-con組比較，miR-365組HUVECs中IRAK1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；相對(duì)于anti-miR-con組，anti-miR-365組HUVECs中IRAK1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖3,表4、5。

圖3 miR-365靶向調(diào)控IRAK1表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-365靶向調(diào)控IRAK1表達(dá)

2.5 過表達(dá)IRAK1部分逆轉(zhuǎn)miR-365對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs的保護(hù)作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LPS+ miR-365+pcDNA組比較，LPS+ miR-365+pcDNA-IRAK1組HUVECs細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 western blot檢測IRAK1、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

表6 過表達(dá)IRAK1和轉(zhuǎn)染miR-365對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs保護(hù)作用的影響

3 討論

手術(shù)、嚴(yán)重創(chuàng)傷后?？梢l(fā)膿毒癥，目前膿毒癥的病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，臨床尚無治療膿毒癥的有效方法，研究表明膿毒癥與免疫失調(diào)、炎性反應(yīng)有關(guān)，炎性介質(zhì)釋放量增加可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管通透性增加、凝血功能異常進(jìn)而引發(fā)多器官功能障礙[9,10]。以上研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因而探究血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制有助于揭示膿毒癥的病理生理學(xué)機(jī)制。既往研究顯示部分miRNA可參與膿毒癥的病理過程并可調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[11]。因此本研究積極探尋新型miRNA并分析其對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及其可能的作用機(jī)制具有重要意義。

miR-365在膝骨關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)異常并可能參與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程[12,13]。miR-365表達(dá)降低與脂肪肝炎性反應(yīng)密切相關(guān)[14]。本研究中LPS誘導(dǎo)的HUVECs中miR-365表達(dá)下調(diào)，提示miR-365表達(dá)水平降低與膿毒癥的發(fā)生有關(guān)。本文檢測miR-365過表達(dá)對(duì)HUVECs增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的HUVECs存活率顯著降低，而miR-365過表達(dá)可明顯提高HUVECs存活率，說明miR-365過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs增殖具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究顯示LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡率顯著升高，miR-365過表達(dá)可明顯降低HUVECs凋亡率，說明miR-365過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡具有明顯抑制作用。線粒體通路是引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要途徑，線粒體膜通透性增加可促使細(xì)胞色素C(Cyt-C)釋放至細(xì)胞漿，Cyt-C與凋亡蛋白酶激活因子結(jié)合可激活Caspase-9，Caspase-9活化后可激活下游凋亡執(zhí)行因子Caspase-3最終促使細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的HUVECs中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高，說明線粒體途徑可能是LPS誘導(dǎo)HUVECs凋亡的機(jī)制之一，同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-365過表達(dá)可明顯降低Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)，提示miR-365過表達(dá)可抑制線粒體途徑進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs凋亡。TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子與膿毒癥發(fā)生過程密切相關(guān)，其水平升高可引發(fā)膿毒癥患者全身炎性反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)HUVECs中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高，而miR-365過表達(dá)可明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提示miR-365過表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)HUVECs炎性反應(yīng)。

IRAK1表達(dá)異常與口腔扁平苔蘚患者體內(nèi)的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[17]。研究表明IRAK1在糖尿病心肌病小鼠中呈高表達(dá)，miR-146可能通過調(diào)控IRAK1介導(dǎo)的炎性反應(yīng)從而參與糖尿病心肌病發(fā)生過程[18]。研究表明抑制IRAK1的表達(dá)可阻滯炎性因子的釋放從而減緩潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展[19]。相關(guān)報(bào)道指出miR-142-3p過表達(dá)可通過抑制IRAK1的表達(dá)而減輕LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)炎性反應(yīng)[20]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)IRAK1是miR-365的靶基因，miR-365可負(fù)向調(diào)控IRAK1的表達(dá)與活性，進(jìn)一步研究顯示IRAK1過表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-365對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVECs的保護(hù)作用，提示miR-365過表達(dá)可通過抑制IRAK1的表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)HUVECs炎性反應(yīng)、抑制HUVECs凋亡及促進(jìn)HUVECs增殖，減緩膿毒癥發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-365可通過下調(diào)IRAK1的表達(dá)影響LPS誘導(dǎo)的HUVECs增殖、凋亡，并抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的分泌，可為揭示膿毒癥發(fā)病機(jī)制提供新方向，可為降低膿毒癥的發(fā)生率提供參考依據(jù)。