張超

橫紋肌溶解癥(RM)是指因擠壓、運(yùn)動(dòng)、藥物等原因所致橫紋肌破壞和崩解，引起內(nèi)環(huán)境紊亂、急性腎損傷(AKI)等組織器官損害的臨床綜合征[1]。AKI是橫紋肌溶解的嚴(yán)重并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為腎功能異常和尿量減少，水電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂加重，其致病機(jī)制包括腎缺血再灌注、肌紅蛋白的直接毒性和管型形成等。RM致AKI發(fā)病率較高，目前治療方法主要有補(bǔ)液、糾正電解質(zhì)紊亂和血液透析等，缺乏足夠的藥物治療手段。

c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路是絲裂酶原活化蛋白激酶信號(hào)(MAPKs)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族的成員之一，參與多種腎臟疾病。在AKI方面，研究表明JNK信號(hào)通路在缺血再灌注、順鉑致AKI等模型中被激活并加重?fù)p傷，使用JNK抑制劑可起到腎保護(hù)作用[2-3]，但JNK在RM致AKI方面的作用尚未見報(bào)道。樺木酸(BA)屬于羽扇豆烷型五環(huán)三萜類物質(zhì)，廣泛分布于樺木科植物中。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，樺樹皮可用于黃疽、乳癰、疥瘡等疾病的治療[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，樺木酸在缺血和膿毒癥引起的腎臟損傷中具有治療作用[5-6]，對(duì)RM致AKI可能也有治療作用，但具體效果和機(jī)制需要實(shí)驗(yàn)證明。

本研究采用甘油肌注法建立大鼠RM致AKI模型，探討損傷后腎臟JNK通路的變化，以及樺木酸的干預(yù)效應(yīng)，為深入認(rèn)識(shí)RM致AKI的發(fā)病機(jī)制及探索新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 選取清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠32只，體質(zhì)量190～210 g，8周齡，均購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為在空調(diào)室中，12 h明暗循環(huán)，溫度(22±2)℃和相對(duì)濕度(50%～60%)保持恒定，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。

主要試劑為樺木酸(西安昊軒提供)、JNK通路拮抗劑SP600125(美國(guó)Sigma提供)、兔抗鼠p-JNK多克隆抗體(美國(guó)CST提供)、兔抗鼠JNK多克隆抗體(美國(guó)CST提供)、兔抗鼠Cleaved Caspase-3多克隆抗體(美國(guó)CST提供)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(美國(guó)CST提供)、檢測(cè)IL-1β的ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma提供)、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國(guó)KPL提供)、BCA檢測(cè)試劑盒(上海生工提供)。如無(wú)特殊說(shuō)明，其余試劑均購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(C，n=8)，甘油肌注組(G，n=8)，甘油+樺木酸組(GB，n=8)，甘油+SP600125組(GS，n=8)。樺木酸和SP600125均使用10%二甲基亞砜(DMSO)稀釋。為了排除溶劑的干擾，對(duì)C組給予腹腔注射10% DMSO 10 ml/kg，1 h后雙側(cè)后肢肌內(nèi)注射生理鹽水10 ml/kg，不給予藥物干預(yù)。G組、GS組和GB組分別于腹腔注射10% DMSO 10 ml/kg、SP600125 15 mg/kg和樺木酸50 mg/kg，1 h后均給予雙側(cè)后肢肌內(nèi)注射50%甘油10 ml/kg。樺木酸、SP600125和甘油的給藥劑量及時(shí)間參照相關(guān)文獻(xiàn)確定[7-9]。從注射生理鹽水/甘油開始計(jì)算，24 h后處死大鼠。將各組大鼠給予戊巴比妥(60 mg/kg)腹腔麻醉后下腔靜脈取血，獲取腎臟組織。

1.2.2 腎功能指標(biāo)及腎IL-1β水平檢測(cè)：血肌酐(Cr)、尿素(BUN)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，腎臟IL-1β水平采用ELISA法測(cè)定，操作均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 腎臟病理學(xué)檢查：將腎臟組織使用多聚甲醛(4%)固定，石蠟包埋，取4 μm切片行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。在病變明顯處用400倍鏡觀察，根據(jù)已報(bào)道的評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行腎小管損傷半定量評(píng)分[10]。小管損傷的定義是上皮細(xì)胞壞死裂解、小管擴(kuò)張、管型形成、細(xì)胞碎片脫落進(jìn)小管腔或基底膜暴露。損傷評(píng)分由受損傷小管所占的比例確定，0分：無(wú)損傷；1分：<20%；2分：21%～50%；3分：>50%；4分：所有上皮細(xì)胞完全破壞。每個(gè)標(biāo)本在皮質(zhì)和外髓部隨機(jī)觀察10個(gè)視野，取平均值作為得分結(jié)果。

1.2.4 Western Blot：使用Western Blot測(cè)定腎臟磷酸化JNK(pJNK)、JNK、Cleaved、Caspase-3和NF-κB的表達(dá)。取部分腎皮質(zhì)，用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液處理后進(jìn)行冰上研磨，2 000 g 4 ℃離心10 min，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。再取等量的組織蛋白，于100 ℃變性8 min后，10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PVDF膜。再用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與特異性磷酸化pJNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶500)、Cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和NF-κB(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜。加入羊抗兔二抗(1 ∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，X線片曝光成像。蛋白條帶的吸光度值測(cè)定采用ImageJ定量分析軟件，GVPDH為內(nèi)參照，測(cè)定蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血肌酐、尿素變化 與C組比較，其余3組血清肌酐、尿素均明顯升高(P<0.05)；與G組比較，GB組、GS組血清肌酐、尿素均降低(P<0.05)；與GS組比較，GB組肌酐水平更低(P<0.05)，而尿素水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血肌酐、尿素水平比較

2.2 腎臟病理變化 C組大鼠腎臟外觀顏色暗紅、飽滿、大小正常，其余各組大鼠腎臟呈現(xiàn)不同程度的紫紅色，體積略增大。HE染色后使用光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，C組大鼠腎組織無(wú)明顯異常。G組大鼠可見腎小管明顯擴(kuò)張變形，管腔內(nèi)可見細(xì)胞碎片，上皮細(xì)胞壞死或脫落，部分細(xì)胞核深染、固縮，少數(shù)腎小管管腔內(nèi)可見管型。與同期G組比較，GB組和GS組大鼠腎病理?yè)p傷評(píng)分降低，其中GB組較GS組降低更加明顯(P<0.05)。各組大鼠腎損傷評(píng)分見表2，腎臟病理變化見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化(HE染色×400)

表2 各組大鼠腎損傷評(píng)分比較分)

2.3 腎組織IL-1β和NF-κB/GAPDH變化 Western Blot及ELISA結(jié)果顯示：C組大鼠IL-1β和NF-κB含量較低；與G組大鼠相比，GB組和GS組大鼠IL-1β和NF-κB水平均下降(P<0.05)；與C組大鼠相比，其余各組大鼠IL-1β和NF-κB水平均上升(P<0.05)。與GB組大鼠相比，GS組大鼠IL-1β和NF-κB降低更加明顯(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠IL-1β和NF-κB/GAPDH變化比較

2.4 腎組織pJNK、JNK和Cleaved Caspase-3變化 Western Blot結(jié)果顯示，各組大鼠之間JNK表達(dá)顯示無(wú)明顯差異。C組pJNK和Cleaved Caspase-3少量表達(dá)。與C組大鼠相比，其余3組大鼠pJNK/JNK和Cleaved Caspase-3/GAPDH比值均上升(P<0.05)。與G組大鼠相比，GB組和GS組大鼠pJNK/JNK和Cleaved Caspase-3/GAPDH比值均降低(P<0.05)。與GS組大鼠相比，GB組大鼠pJNK/JNK比值較高(P<0.05)，但Cleaved Caspase-3/GAPDH比值較低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠pJNK/JNK和Cleaved Caspase-3/GAPDH變化比較

3 討 論

多種遺傳性或獲得性疾病都可導(dǎo)致橫紋肌損傷，常見病因包括嚴(yán)重?cái)D壓、過(guò)度訓(xùn)練、服用他汀類藥物等。這些因素導(dǎo)致肌細(xì)胞膜完整性發(fā)生改變，繼而肌細(xì)胞內(nèi)容物如肌紅蛋白、肌酸激酶、離子和小分子物質(zhì)釋放入血，導(dǎo)致肌肉疼痛腫脹，出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂和AKI等[11]。特別是血漿肌紅蛋白水平在短時(shí)間內(nèi)迅速升高，通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜進(jìn)入腎小管，導(dǎo)致過(guò)氧化反應(yīng)、炎性反應(yīng)和腎小管堵塞。AKI是橫紋肌溶解最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，腎臟功能損傷可進(jìn)一步加重患者水電解質(zhì)及酸堿代謝的紊亂。如不及時(shí)處理，患者可出現(xiàn)呼吸衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血甚至多臟器功能衰竭等嚴(yán)重后果。

甘油相對(duì)分子質(zhì)量為92.09，具有較高的滲透壓，根據(jù)溶液熱力學(xué)相關(guān)定律計(jì)算，體積比為2.6%的甘油水溶液與血漿等滲。將50%甘油水溶液注射入大鼠后肢肌肉后，引起肌細(xì)胞的損傷和崩解，導(dǎo)致肌細(xì)胞內(nèi)容物釋放入血。既往研究在橫紋肌損傷24 h后，腎臟的結(jié)構(gòu)和功能損傷較為明顯[9]，因此本研究將注射甘油后24 h作為觀察時(shí)點(diǎn)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，Cleaved Caspase-3是其活化形式，組織Cleaved Caspase-3表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)。NF-κB是炎性反應(yīng)的重要因素，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子，參與炎性反應(yīng)放大與延續(xù)。IL-1β為一種致炎細(xì)胞因子，廣泛參與人體組織中的炎性反應(yīng)。故本實(shí)驗(yàn)采用Cleaved Caspase-3代表腎臟細(xì)胞凋亡程度，采用NF-κB和IL-1β反映腎臟炎性反應(yīng)水平。

MAPKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是由廣泛的細(xì)胞外刺激激活的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，可將各種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。根據(jù)活化部位的序列不同，常見的MAPKs主要有ERK1/2、JNK、P38和ERK5共4條途徑[12]。磷酸化是此類激酶的活性形式，正常情況下，這些激酶活性較低，但是在應(yīng)激條件下會(huì)顯著增加，影響下游多種效應(yīng)因子。這些酶具有不同的生物學(xué)功能，包括核小體的調(diào)節(jié)和基因表達(dá)，mRNA穩(wěn)定性及細(xì)胞增殖和存活[13]。MAPKs參與各種原因引起的急性腎損傷，但相關(guān)研究結(jié)果并不一致。JNK又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)，分為3種同工型：JNK1和JNK2具有廣泛的組織分布，而JNK3主要局限于神經(jīng)元組織、睪丸和心肌細(xì)胞[14]。JNK通路參與多種腎臟疾病，在AKI方面，有研究表明JNK通路在缺血再灌注、順鉑致急性腎損傷等模型中被激活，使用JNK抑制劑可起到腎保護(hù)作用[2-3]，但在橫紋肌溶解致急性腎損傷模型中的變化和作用尚未得到驗(yàn)證。SP600125是目前較為常用的JNK廣譜抑制劑，可通過(guò)選擇性競(jìng)爭(zhēng)ATP位點(diǎn)阻止其活化。在本實(shí)驗(yàn)中，給予甘油肌注后，大鼠pJNK/JNK比值明顯升高。給予SP600125干預(yù)后，pJNK/JNK比值明顯降低，同時(shí)NF-κB和IL-1β減少，腎損傷減輕，腎功能改善。這表明在RM致AKI中，JNK被激活，并可通過(guò)誘導(dǎo)炎性反應(yīng)加重腎損傷。SP600125通過(guò)抑制JNK的激活減輕這一效應(yīng)。

樺木酸廣泛分布于樺木科植物中，以白樺樹皮含量為高[15]，白樺樹皮可用于治療黃疽、乳癰、疥瘡等疾病。現(xiàn)代研究證明，樺木酸具有優(yōu)越的抗腫瘤和抗HIV活性，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激等多種生物活性[4]。