王 悅 張 強 李美秋 寇曉涵 鄭 健

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150040）

樺木酸（betulinic acid，BA）又稱白樺脂酸，是一種羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物，為一種三萜烯，E 環(huán)為五元碳環(huán)，C-3 位上的羥基為β-OH，28位為羧基，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。樺木酸易溶于吡啶、四氫呋喃，溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等溶劑中，不溶于水。樺木酸具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗艾滋病病毒、抗菌、抗炎、抗寄生蟲，并在改善免疫力、調(diào)節(jié)血糖方面也有一定功效，且安全性高。雖然樺木酸廣泛存在于樺樹（圖2）等多種植物中，但含量較低，水溶性差，因此，樺木酸提取及合成的相關(guān)研究，對腫瘤等疾病的治療及生物活性利用都具有重要的意義。

圖1 樺木酸結(jié)構(gòu)

圖2 樺樹

1 樺木酸提取及合成

樺木酸廣泛存在于樺木屬植物白樺中，桉樹球、胡蘆巴、桑白皮、酸棗仁、杜仲、柿蒂、睡菜葉、迷迭香、匙萼金絲桃及蘋果等植物中也發(fā)現(xiàn)樺木酸的存在。近年來，在其他植物中也檢測到樺木酸。徐凌玉等［1］采用多種柱色譜技術(shù)對薄荷提取得到的天然產(chǎn)物進行分離純化，利用波譜分析方法鑒定，分離得到11 個化合物，其中包括樺木酸。王麗華等［2］檢測暴馬丁香中樺木酸的含量發(fā)現(xiàn)，枝條中樺木酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，樹皮中次之，葉片中最低。王宇等［3］利用超聲輔助提取工藝從澤蘭中提取并測定了樺木酸含量為（5.31±0.04）mg／g，高于酸棗仁。

樺木酸的制備方法已取得一定進展，獲得方式一般有直接提取法、化學(xué)合成法及生物合成法。

1.1 直接提取法 直接提取法即以甲醇、乙醇、氯仿等有機溶劑作為溶劑進行提取，再將獲得的粗品純化，從而獲得純品的方法。例如，從烏骨藤中提取樺木酸時，用數(shù)量倍的70%乙醇將烏骨藤加熱回流2～3 次，將提取液減壓蒸干，依次通過石油醚、乙酸乙酯、飽和正丁醇萃取劑進行萃取，再將萃取液減壓蒸干，經(jīng)柱層析梯度洗脫，再經(jīng)液相色譜儀純化，即可得到樺木酸純品。Djamen 等［4］在真空中濃縮黃花苜蓿小枝的甲醇提取物，然后通過硅膠柱色譜分離，得到3 種新的五環(huán)三萜類化合物和14 種已知的代謝物，其中包括樺木酸。目前，直接提取法包括以下方式：加壓液體萃取法、超臨界萃取法、亞臨界水提取、超聲波提取法。

1）加壓液體萃取法。加壓液體萃取法是在較高的溫度和壓力下，用溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的技術(shù)，其萃取是在一個加壓并配備溶劑控制器的萃取系統(tǒng)內(nèi)進行。Pinilla 等［5］依次用甲醇、乙酸乙酯作為萃取劑萃取，經(jīng)過多次階梯式升溫得到萃取液，最后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到樺木酸粗品。此方法提取過程自動化，極大縮短萃取時間，節(jié)約人力，明顯降低萃取溶劑使用量，成本較小，且萃取過程在密閉系統(tǒng)中進行，減少溶劑揮發(fā)和對人體的危害，減少環(huán)境污染，但是樣品收率低。

2）超臨界萃取法。超臨界萃取法具有萃取和分離的雙重作用，目前，此技術(shù)在去除有害成分、提取有效成分的研究上，已取得明顯的成果。Krasutsky 等［6］利用超臨界萃取法，從樺樹皮中提取樺木酸，純度可高達95%。Plander 等［7］將超臨界流體超高性能收斂色譜系統(tǒng)與蒸發(fā)光散射檢測器結(jié)合，從梧桐樹樹皮中提取出樺木酸。超臨界萃取法環(huán)保高效，成本低，應(yīng)用前景十分廣泛。

3）亞臨界水提取。亞臨界水提取技術(shù)是通過改變萃取溫度改變水的極性、表面張力和粘度，進而從樺樹皮中選擇性地萃取樺木酸。Liu 等［8］利用亞臨界水提取法從樺樹皮中提取樺木酸，收率高于傳統(tǒng)提取方法，且提取物中的雜質(zhì)更少。此方法通常用于萃取難萃取的天然產(chǎn)物，在短時間內(nèi)完成，并可連續(xù)處理。由于提取時間短、成本低、無污染，又稱為“綠色的處理法”。

4）超聲波提取法。超聲波提取法可從植物中提取生物活性物質(zhì)，將化學(xué)試劑與原料按一定的比例混合，置于已設(shè)定頻率和溫度的超聲容器內(nèi)，在一定的溫度下，內(nèi)容物釋放，并溶解于化學(xué)試劑中。Hossain 等［9］以懸鈴木樹皮為原料，將乙酸乙酯與樹皮混合后置于超聲容器中，獲得樺木酸。Song 等［10］從棗果中使用超聲法提取了總?cè)祁惢衔?，其中包括樺木酸。超聲波提取法高效?jié)能，制備工藝簡單，應(yīng)用也較廣泛。

1.2 化學(xué)合成法 化學(xué)合成法包括直接合成法和半步合成法。

1）直接合成法。直接合成法是在利用乙醇等有機溶劑提取樺木醇的同時，將四甲基哌啶等氧化劑附著在固體載體上，在50℃下氧化提取物，即可得到樺木酸。由于直接合成法同時提取樺木醇和制備樺木酸，雜質(zhì)種類及含量較多，由此影響樺木酸純度，產(chǎn)率也很低，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用困難。

2）半步合成法。半步合成法有2 種方式，一種是以樺木醛為中間體制備樺木酸，另一種以樺木酮酸為中間體制備樺木酸。Pichette 等［11］采用第1種方式，將氧化劑CrO3吸附在硅膠上，在SiO2的催化下，樺木醇氧化為樺木醛，再以高錳酸鉀作為氧化劑、丙酮作為溶劑將樺木醛氧化為樺木酸。此方法產(chǎn)物復(fù)雜，難以分離純化，且產(chǎn)率較低，因此，基本不使用這種方法。第2 種方式是用瓊斯試劑作為氧化劑、丙酮作為溶劑，將樺木醇氧化為樺木酮酸，再以硼氫化鈉作為還原劑、THF 作為溶劑，將樺木酮酸還原得到樺木酸［12］。此方法操作簡便，反應(yīng)條件較溫和，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。Hossain 等［9］用IBX作為氧化劑，在DMSO 和THF 混合溶劑中，樺木醇氧化為樺木酮醛，然后在四丁基高錳酸銨作用下，將樺木酮醛氧化為樺木酮酸，最后，樺木酮酸在硼氫化鈉的作用下還原為樺木酸。此方法操作簡單，樺木酸的收率較高。謝洋等［13］以樺木醇作為原料，在丙酮溶液中與K2CrO7-H2SO4進行催化氧化成樺木酮酸，再以NaBH4為還原劑合成樺木酸。陶冉等［14］對樺木醇C-28 和C-29 位進行修飾，引入醛基，得到C-28 位和C-29 位樺木酸。此法相比于樺木醇半合成法工藝更簡單，轉(zhuǎn)化率和樺木酸純度都較高，應(yīng)用前景較好。

1.3 生物合成法 樺木酸廣泛分布于多種植物中，雖然化學(xué)合成法是獲取樺木酸的主要方法，但存在收率低、高耗能等問題。三萜酸類化合物的生物合成途徑過程一般有3 個階段，分別為中間體異戊烯基焦磷酸（IPP）和異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）的生成、基本前體物質(zhì)鯊烯的生成，以及三萜酸類化合物的生成。在某些植物細胞中，羽扇豆醇合成酶（LUP）催化2，3-環(huán)氧鯊烯生成羽扇豆醇，再由CYP716A 亞家族C-28 氧化酶及其還原伴侶（CPR）催化羽扇豆醇在C-28 位發(fā)生3 次連續(xù)氧化，依次轉(zhuǎn)化成樺木醇、樺木醛，最后生成樺木酸［15］。

Chen 等［16］發(fā)現(xiàn)樺木酸可能通過微生物降解，經(jīng)氧化后可生成樺木酸或其他代謝產(chǎn)物，經(jīng)實驗，他們從8 個菌株中篩選出樺木酸收率最好的菌株——臭曲霉菌；Feng 等［17］將小克銀漢霉菌和蜜環(huán)菌在含有樺木醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在這2 種菌的代謝產(chǎn)物上都分離得到了樺木酸；Li 等［18］發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母可通過平衡脂肪酸和樺木酸生物轉(zhuǎn)化機制提高樺木酸產(chǎn)率。王冬［15］首先在三萜底盤細胞BYT3 的rDNA 多拷貝位點引入來自烏拉爾甘草的羽扇豆醇合酶基因，以及MVP 途徑限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶基因，從而獲得樺木酸前體羽扇豆醇的底盤細胞BY-LUP02，經(jīng)過篩選7 種細胞色素P450 還原酶，得到效果最佳的擬南芥細胞色素P450 還原酶2，最終獲得高產(chǎn)樺木酸的細胞工廠BY-BA42。黃嘉鍵［19］將擬南芥中的羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs及RoCYP-34445，導(dǎo)入至釀酒酵母BY4741 細胞中，在酵母體內(nèi)構(gòu)建了樺木酸生物合成途徑。從目前研究來看，雖然生物轉(zhuǎn)化機制較為復(fù)雜，但成本低，反應(yīng)條件溫和，安全環(huán)保，因此受到人們關(guān)注，仍需進一步研究。

除了以上幾種獲取樺木酸的方法之外，還有一些新興方法，例如，通過生物活性引導(dǎo)的分級分離法等。

2 樺木酸的藥理活性

樺木酸具有多種藥理活性，主要包括抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗菌消炎等，對于治療艾滋病及改善免疫力等方面也有顯著效果。

2.1 樺木酸抗腫瘤的研究 最早Pisha 等［20］發(fā)現(xiàn)樺木酸會誘導(dǎo)細胞凋亡進而抑制黑色素瘤生長。目前，已取得的研究結(jié)果顯示，樺木酸及其衍生物對多種腫瘤細胞具有廣泛的作用，例如，對乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、成膠質(zhì)瘤、骨肉瘤及橫紋肌肉瘤等均有抑制作用。樺木酸有一定的毒性，但毒性極低，研究發(fā)現(xiàn)即使劑量高達500 mg／kg 時，小鼠也并未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，且對多種腫瘤細胞有較強的抑制毒殺效應(yīng)，而目前臨床上常用的腫瘤藥物細胞毒性較大，因此，樺木酸用做抗腫瘤藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，樺木酸抗腫瘤作用的機理包括改變?nèi)旧w的特征、直接作用于DNA、增強免疫機制及鈣泵活性、抑制酶類及影響細胞周期，以發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

對于頭頸癌，樺木酸是通過增強caspase 的活性，抑制前細胞凋亡蛋白進而毒殺瘤細胞。研究表明，樺木酸作用于神經(jīng)內(nèi)胚層瘤的線粒體，使其釋放凋亡因子，進而誘導(dǎo)腫瘤凋亡［21］。由于樺木酸對人肺癌A549 和Lewis 肺癌小鼠有明顯的抗腫瘤作用，閔雨［22］通過體外實驗，以抑瘤率為指標(biāo)，研究樺木酸的最佳劑量?；熕幬锿ǔa(chǎn)生耐藥性，Zhan 等［23］研究了樺木酸對紫杉醇抗性肺癌細胞系（H460）的抗癌潛力，結(jié)果表明，樺木酸可能是治療耐藥性肺癌的有用藥物。Yang 等［24］評估樺木酸在體外和體內(nèi)對人腎癌細胞的抗癌活性，證明了BA 在人腎癌細胞中的抗癌潛力是通過觸發(fā)細胞凋亡并抑制其遷移和侵襲實現(xiàn)的。

2.2 樺木酸抗氧化應(yīng)激的研究 自然界有很多天然活性物質(zhì)能調(diào)控機體的氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)，保障機體穩(wěn)態(tài)及正常的生理機能。研究表明，樺木酸對機體具有抗氧化應(yīng)激作用。黃淑賢等［25］發(fā)現(xiàn)樺木酸能提高大鼠胃粘膜組織中SOD、GSHPx活性，降低MAD 含量，說明樺木酸能保護胃黏膜損傷、增強胃粘膜抗氧化能力及抑制自由基。地塞米松（Dex）是一種有效的抗炎及免疫抑制劑，已被證明可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，Zhu 等［26］發(fā)現(xiàn)BA可有效減輕Dex 誘導(dǎo)的氧化損傷。這些保護作用可能部分通過JNK-P38 MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)，BA 可能由于其抗氧化特性而成為潛在的治療劑。易想煉等［27］通過實驗發(fā)現(xiàn)，樺木酸能改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的氧化損傷有預(yù)防性的保護作用。

2.3 樺木酸抗艾滋病的研究 艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征，目前臨床治療方法主要是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。但有60%的患者由于藥物毒性和耐藥性而導(dǎo)致治療失敗，因此，研制新的抗病毒藥物十分迫切。研究表明，樺木酸類衍生物抗艾滋病主要有3 種方式：樺木酸抑制病毒與細胞膜融合過程中的后結(jié)合、作為HIV 成熟抑制劑，以及同時作為HIV-1 融合和成熟抑制劑。與目前所使用的抗HIV-1 藥物相比，樺木酸針對性更強，不良反應(yīng)較小，有很大的應(yīng)用前景。

2.4 樺木酸免疫調(diào)節(jié)的研究 樺木酸最主要的作用還包括免疫調(diào)節(jié)。Freysdottir 等［28］發(fā)現(xiàn)樺木酸可調(diào)節(jié)人單核細胞衍生的樹突細胞，使其與T 細胞相互作用，進而發(fā)生免疫作用。易金娥等［29］在體外測定了小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平、吞噬能力、腫瘤壞死因子分泌量與谷胱甘肽過氧化物酶活性、胞外NO 釋放量及SOD 與溶菌酶活性的影響，對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樺木酸能激活巨噬細胞，提高其吞噬能力和能量代謝水平，增強抗氧化能力，提高機體的免疫力。

2.5 樺木酸抗菌、抗炎的研究 研究發(fā)現(xiàn)，樺木酸在體外能降低微生物的活性，例如，枯草桿菌、大腸桿菌、微球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及結(jié)核分支桿菌等，但對橘青霉無任何毒性作用［30］。樺木酸對血清素和角叉菜膠所引起的大鼠足底腫脹也有明顯的抑制作用［31］。樺木酸還可減輕銀屑病癥狀和炎性皮膚病變［32］。除了對實驗性炎癥模型有明顯的抗炎作用之外，樺木酸與其他天然產(chǎn)物還有協(xié)同抗炎的作用［33］。

2.6 樺木酸抗寄生蟲的研究 樺木酸能在體外抑制惡性瘧原蟲，且對紅細胞期的瘧原蟲抑制效果更強，樺木酸C-3 和C-28 衍生物可在體外抗瘧原蟲，并表現(xiàn)出較強的活性［34］，但體內(nèi)試驗并無明顯作用。研究發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯提取的樺木酸培養(yǎng)蠕蟲7 d，其死亡率高達98%，效果十分明顯［35］。

2.7 其他藥理活性的研究 樺木酸具有很高的抗糖尿病活性，通過激活電生理機制刺激胰島素的分泌，并誘導(dǎo)與代謝生化作用相關(guān)的細胞去極化，進而激活PKC 并確保胰島素的分泌［36］。眾所周知，糖尿病會導(dǎo)致許多并發(fā)癥，其中糖尿病引起的肝臟病變最為常見，包括非酒精性脂肪肝及肝纖維化。劉妙娜等［37］對四氯化碳誘導(dǎo)雄性大鼠肝纖維化的小鼠進行樺木酸干預(yù)治療，并以秋水仙素作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樺木酸具有抗肝纖維化的活性。最新研究表明，樺木酸還有可通過保護微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)和上調(diào)BDNF 表達而在老年性癡呆（AD）的治療中發(fā)揮作用［38］。血管性癡呆（VaD）是老年性癡呆的第2 種最常見形式，樺木酸能保護神經(jīng)，并具有恢復(fù)認知障礙和海馬神經(jīng)化學(xué)的能力［39］。此外，樺木酸還具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、驅(qū)蠕蟲、抗?jié)?、抗HSV-1 的作用。

3 展望

樺木酸的合成及其藥理作用一直是研究的熱點，樺木酸及衍生物對于抗腫瘤、抗艾滋、抗菌、抗炎、抗寄生蟲等具有較強的生物活性，且毒性低，安全性高，應(yīng)用前景廣闊。隨著研究的深入和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，樺木酸制備方法也在不斷優(yōu)化，這為樺木酸藥理作用的應(yīng)用也起到了推動作用。目前，研究人員利用納米技術(shù)，不僅保留樺木酸的生物活性，還解決了樺木酸水溶性差的缺點；此外，人們也致力于合成多種樺木酸的衍生物，以改善樺木酸的缺點，提高其應(yīng)用前景。雖然樺木酸研究廣泛，但樺木酸在抗炎抗菌等藥理方面應(yīng)用還很少，具有進一步研究的價值。