鄧浩輝，劉惠媛，高洪波，陳偉烈

目前，二代宏基因組測序技術(shù)已廣泛用于臨床，能對樣本的微生物構(gòu)成進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，但其受限于實驗原理，測序速度相對較慢。根據(jù)文獻(xiàn)報道，納米孔三代測序(Oxford Nanopore Technologies)相對于二代測序?qū)颖静≡瓕W(xué)鑒定具有更快速且能保持準(zhǔn)確性的優(yōu)勢。目前該技術(shù)對人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征(Human Immunodeficiency Virus/Acquired Immunedeficiency Syndrome，HIV/AIDS)合并肺部感染者快速病原學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性評估尚未見相關(guān)報道，現(xiàn)報道如下。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 本研究納入2019年8月-9月在廣州市第八人民醫(yī)院住院治療的2例HIV/AIDS合并肺部感染者，患者A為男性69歲，患者B為男性60歲。2例患者均留取纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本?；颊逪IV/AIDS的診斷符合《中國艾滋病診療指南(2018版)》[1]。患者肺部感染的診斷符合《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018版)》[2]，臨床標(biāo)本的留取參照 WS/T640-2018臨床微生物學(xué)檢驗標(biāo)本的采集和轉(zhuǎn)運的標(biāo)準(zhǔn)。納入研究的2例患者均簽署知情同意書。

1.2 常規(guī)實驗室檢查 本研究2例患者的肺泡灌洗液樣本均進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌和真菌培養(yǎng)，并常規(guī)行結(jié)核DNA(PCR法)和GeneXpert MTB/RIF等方法對樣本的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測?；颊哐Ｒ?guī)檢測使用X1000全自動血液分析儀(日本Sysmex公司)，血清降鈣素原使用Cobas 801全自動電化學(xué)分析儀(瑞典Roche公司)，CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)使用Canto II流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(美國BD公司)。

1.3 樣本DNA提取和測序文庫的構(gòu)建

1.3.1 纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本DNA提取 纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本首先使用液氮研磨進(jìn)行預(yù)處理，使樣本中的微生物充分裂解，處理后的樣本使用Qiamp DNA Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行樣本總DNA提取，提取后的核酸使用NanoDrop2000核酸檢測儀(美國Thermo Fisher公司)進(jìn)行定量檢測。

1.3.2 DNA文庫的構(gòu)建與測序 本研究相同的樣本均使用納米孔三代測序和Illumina二代測序進(jìn)行建庫，以比較兩種測序方法的準(zhǔn)確性。納米孔三代測序DNA文庫的構(gòu)建使用快速1D建庫試劑盒SQK-RAD004(英國Oxford Nanopore Technologies公司)進(jìn)行建庫。構(gòu)建好的DNA文庫使用Flow cells R9.4測序芯片和MinION測序儀(英國Oxford Nanopore Technologies公司)進(jìn)行測序。Illumina二代測序文庫的構(gòu)建使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒(美國NEB公司)進(jìn)行DNA文庫的構(gòu)建，構(gòu)建的DNA文庫使用Illumina Hiseq平臺(美國Illumina公司)，PE150模式進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 原始測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和過濾 納米孔三代測序MinION測序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)文件格式為fast5，使用MinKNOW軟件完成實時識別并生成的fastq文件，然后提取不同時間1、3、6、12、24 h和所有27 h的測序數(shù)據(jù)，并通過MinKNOW軟件過濾低質(zhì)量值序列。Illumina二代測序的原始數(shù)據(jù)使用FASTX-Toolkits軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，剔除Q30小于90%和長度小于35bp的序列，剩余序列進(jìn)行下游數(shù)據(jù)分析。過濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行去宿主DNA操作(使用人基因組參考序列Hg38)，納米孔三代測序數(shù)據(jù)使用Minimap2軟件及Illumina二代測序的數(shù)據(jù)使用Bowtie2軟件進(jìn)行去宿主DNA序列。

1.4.2 測序數(shù)據(jù)多序列比對和致病微生物的判定經(jīng)數(shù)據(jù)過濾和去宿主DNA的測序數(shù)據(jù)使用Centrifuge v1.0.3進(jìn)行與NCBI非冗余核酸數(shù)據(jù)(NT)庫進(jìn)行多序列比對。原始的微生物比對結(jié)果中除病原微生物外，還包括了大量的背景微生物，因此需要設(shè)立致病菌的判定標(biāo)準(zhǔn)：①本研究納入的樣本為纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本，剔除正?？谘什课⑸?；②查閱相關(guān)文獻(xiàn)，排除與肺部感染無關(guān)的微生物；③對于細(xì)菌、病毒和寄生蟲，物種覆蓋度(CR)水平大于其他微生物10倍以上；對于真菌，CR大于5倍以上；對于結(jié)核分枝桿菌，因提取的DNA含量低，故只要檢測一條序列，即判定為陽性[3-4]；④排除細(xì)菌(結(jié)核除外)、真菌、病毒序列數(shù)少于3的微生物[5]。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)檢查結(jié)果 本研究納入2例HIV/AIDS合并肺部感染者，CT檢查均提示雙肺多發(fā)感染，半乳甘露聚糖和1，3-β-D葡聚糖試驗均為陰性?；颊逜入院后查白細(xì)胞為7.59×109/L，中性粒細(xì)胞比例為88.2%，降鈣素原0.096 ng/L，CD4+細(xì)胞計數(shù)264/μL，肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)提示銅綠假單胞菌感染?；颊連入院后查白細(xì)胞為6.47×109/L，中性粒細(xì)胞比例為80.5%，降鈣素原0.130 ng/L，CD4+細(xì)胞計數(shù)142/μL，肺泡灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)提示肺炎克雷伯桿菌和屎腸球菌混合感染，結(jié)核DNA檢測陽性，GeneXpert MTB/RIF檢查提示樣本中結(jié)核分枝桿菌陽性。

2.2 樣本測序的數(shù)據(jù)量 納米孔三代測序和Illumina二代測序的原始數(shù)據(jù)量和過濾后的數(shù)據(jù)量(表1)，患者A和患者B的纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本對應(yīng)為樣本A和樣本B。樣本A和樣本B納米孔三代測序所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)量分別為10.2 G和11.3 G，平均序列長度分別為(1.35±0.42)Kb和(1.40±0.5)Kb。樣本A和樣本B的Illumina二代測序原始數(shù)據(jù)量為8.3 G和8.5 G。納米孔三代測序不同時間產(chǎn)生的序列數(shù)和Illumina二代測序產(chǎn)生的序列數(shù)，表1。

表1 納米孔三代測序和Illumina二代測序原始和去宿主后的序列數(shù)(條)

2.3 納米孔三代測序快速病原學(xué)鑒定結(jié)果分析 本研究中，樣本A纖維支氣管鏡肺泡灌洗液常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果提示樣本中的致病菌為銅綠假單胞菌，二代測序的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的基因序列，納米孔三代測序僅1 h的測序結(jié)果已可檢測出該菌的基因序列；在樣本B中，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和病原學(xué)檢查的結(jié)果提示肺炎克雷伯桿菌、屎腸球菌和結(jié)核分枝桿菌混合感染，二代測序的結(jié)果也提示上述致病菌感染，對納米孔三代測序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果提示，在測序1 h后，即可檢測出肺炎克雷伯桿菌和屎腸球菌基因序列，6 h的測序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的序列，表2。

表2 納米孔三代測序和Illumina二代測序檢測致病微生物的序列數(shù)(條)

3 討論

對于感染性疾病，確定病原體的時間非常重要，建立快速病原鑒定的方法對合理使用抗感染藥物有重要的指導(dǎo)作用[6]。傳統(tǒng)的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)技術(shù)耗時較長，且微生物培養(yǎng)的陽性率受限于方法學(xué)和抗菌素治療的影響，大部分的細(xì)菌和真菌在常規(guī)的培養(yǎng)條件下難以生長[7]。目前，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，二代宏基因組測序(Illumina和IonPGM測序等平臺)已廣泛應(yīng)用于科研和臨床診療[8]，其結(jié)果可指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，提高臨床療效，改善患者預(yù)后[9]，二代測序?qū)ξ⑸餀z測的靈敏度和準(zhǔn)確性高，但受限于其實驗原理，獲取結(jié)果需耗時3 d以上。根據(jù)文獻(xiàn)報道，納米孔三代宏基因組測序能在極短時間內(nèi)對樣本中的微生物進(jìn)行快速病原學(xué)鑒定[10-11]，但目前評估該技術(shù)在HIV/AIDS合并肺部感染者快速病原學(xué)鑒定準(zhǔn)確性的研究未見報道。

HIV/AIDS患者由于天然免疫，細(xì)胞和體液免疫受損[12-13]，常合并各種機(jī)會性感染，其中肺部感染是HIV/AIDS患者最常見的機(jī)會性感染[14]。HIV/AIDS肺部感染常為多種致病菌混合感染[15]，且反復(fù)發(fā)生。嚴(yán)重的肺部感染常合并呼吸衰竭，是HIV/AIDS患者死亡率上升的主要原因，而快速準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷對治療肺部感染和減少患者死亡率至關(guān)重要。

本研究中，對2例HIV/AIDS合并肺部感染者纖維支氣管鏡肺泡灌洗液樣本進(jìn)行研究，結(jié)果表明，納米孔三代測序僅1 h的測序結(jié)果即可檢測出樣本致病菌(銅綠假單胞菌，肺炎克雷伯桿菌和屎腸球菌)的基因序列，6 h的測序結(jié)果已可檢測結(jié)核分枝桿菌的基因序列，外加樣本處理和DNA文庫構(gòu)建，生物信息學(xué)分析(約2 h)，僅需8 h即可檢測出上述樣本致病微生物的組成，且結(jié)果與常規(guī)病原學(xué)檢查和Illumina二代測序的結(jié)果基本一致，提示納米孔三代測序能在極短的時間準(zhǔn)確判斷樣本中的微生物組成。

綜上所述，納米孔三代測序的快速測序模式可快速且準(zhǔn)確地了解HIV/AIDS合并肺部感染者肺泡灌洗液的微生物組成，為患者合理使用抗感染藥物提供理論依據(jù)。由于納米孔三代測序的成本問題，本研究僅納入2例患者進(jìn)行研究，仍需納入更多臨床樣本進(jìn)行研究驗證其準(zhǔn)確性。另外，本研究僅對樣本的DNA進(jìn)行測序，下一步研究應(yīng)對樣本的RNA進(jìn)行測序，進(jìn)一步評價其在病毒宏基因組測序中的準(zhǔn)確性。