蘭 堅(jiān)，楊蜀錦，李 妮，王 嬌

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBCL)屬B細(xì)胞非霍金奇淋巴瘤(Non-Hodhkin′s Lymphoma，NHL)常見(jiàn)類型，侵襲性強(qiáng)，進(jìn)展快，其臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)、免疫表型及遺傳特點(diǎn)均存在異質(zhì)性，療效評(píng)估及預(yù)后判斷難度大，不利于指導(dǎo)臨床決策[1-2]。目前亟待尋找有效生物標(biāo)志物指導(dǎo)預(yù)后分層。即往多采用國(guó)際預(yù)后指數(shù)(International Prognostic Index，IPI)評(píng)估DLBCL患者預(yù)后，包含年齡、一般狀態(tài)評(píng)分、分期、結(jié)外受累、血清乳酸脫氫酶等參數(shù)，但近期報(bào)道顯示，即便存在相同IPI患者仍可能出現(xiàn)不同預(yù)后，提示僅依靠臨床特點(diǎn)評(píng)估DLBCL患者預(yù)后存在局限性[3]。最新研究認(rèn)為，基因表達(dá)譜與DLBCL細(xì)胞起源密切相關(guān)[4]。微小RNA(Micro-RNA，miRNA)系一類非編碼單鏈小分子RNA，參與靶基因調(diào)控，在細(xì)胞分化、增殖及凋亡等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[5]。miR-125位于染色體19q13，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在惡性血液疾病中表達(dá)異常上調(diào)[6]，但與DLBCL患者發(fā)病、病理特征及預(yù)后的關(guān)系尚未完全明確。為探討DLBCL患者miR-125表達(dá)特征、病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并為DLBCL防治提供依據(jù)，現(xiàn)對(duì)收治的148例DLBCL患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性采集2015年3月-2017年3月于四川大學(xué)華西醫(yī)院血液內(nèi)科收治的148例DLBCL患者的臨床資料，作為DLBCL組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì),中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)淋巴瘤專業(yè)委員會(huì)《中國(guó)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)》中DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，經(jīng)活檢組織病理及免疫組化(包括生發(fā)中心來(lái)源與非生發(fā)中心來(lái)源DLBCL；免疫母細(xì)胞性、中心母細(xì)胞性、變異性形態(tài)學(xué))確診，病理見(jiàn)侵襲性大B淋巴細(xì)胞腫瘤，彌漫性生長(zhǎng)，癌細(xì)胞核與正常組織細(xì)胞核接近或增大，細(xì)胞體積較正常淋巴細(xì)胞小(不超過(guò)2倍)；腫瘤直徑>0.5 cm；采集標(biāo)本前未接受放化療或其他治療；初發(fā)；臨床及隨訪資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：血管內(nèi)及縱膈大B細(xì)胞淋巴瘤；累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)者；嚴(yán)重心肝腎肺功能不全；合并其他惡性腫瘤；其他惰性淋巴瘤轉(zhuǎn)化為DLBCL者；合并人類免疫缺陷病毒感染；臨床及隨訪資料不全者。其中男85例，女63例；年齡20～78歲，平均(56.41±10.35)歲；Ann Arbor臨床分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期94例；IPI評(píng)分[9]：0～2分94例，3～5分54例。選擇同期收治淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(Reactive Hyperplasia of Lymph Node，RH)患者35例作為對(duì)照組。其中男20例，女15例；年齡20～76歲，平均(55.97±9.86)歲。

1.2 方法

1.2.1 miR-125表達(dá)水平檢測(cè) 入院后采集DLBCL及RH病理組織標(biāo)本，連續(xù)10 μm厚度切片，二甲苯固定，14 000 r/min離心120 s后，棄二甲苯，無(wú)水乙醇震蕩混合均勻，離心后棄上清，加入無(wú)水乙醇，震蕩均勻，離心，室溫晾干，參照RNA抽提試劑盒提取總RNA(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，鑒定純度及濃度滿意后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司)，反應(yīng)體系：dNTPs 0.15 μL+Reverse Transcroptase 1.0 μL+10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL+RNase Inhibitor 0.19 μL+Nuclese-free water補(bǔ)足至7.0 μL，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied公司)，反應(yīng)體系：20×TaqMan?Small RNA Assay 1.0 μL+RT reaction 1.33 μL+TaqMan?Universal PCR Master MixⅡ 10.0 μL+Nuclese-free water補(bǔ)足至20.0 μL，上美國(guó)ABI公司7500型熒光定量PCR反應(yīng)儀器進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃、 120 s，95 ℃、 10 min，95 ℃、 15 s，60 ℃、 60 s，共40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參，U6引物、miR-125引物設(shè)計(jì)及合成均由美國(guó)Gene Copoeia公司進(jìn)行，參照2-△△Ct公式計(jì)算miR-125相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 臨床資料收集 調(diào)取所有DLBCL患者臨床資料，包括性別、年齡、免疫表型、原發(fā)部位、Ann Arbor臨床分期、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(血清乳酸脫氫酶水平)、IPI評(píng)分、體能狀態(tài)評(píng)分[10]、B癥狀、結(jié)外累及情況、Ki-67指數(shù)等，分析miR-125與DLBCL患者臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系。

1.3 隨訪 所有患者均完成3年隨訪調(diào)查，采用電話隨訪、門(mén)診復(fù)查等方式，自首次明確病理診斷開(kāi)始隨訪，統(tǒng)計(jì)所有患者總生存期(Overall Survival，OS)(自確診至DLBCL所致死亡或隨訪終止時(shí)間)。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組與對(duì)照組患者組織miR-125表達(dá)水平比較 DLBCL組患者組織miR-125表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(t=16.886，P<0.05，圖1)。

圖1 DLBCL組與對(duì)照組患者組織miR-125表達(dá)水平

2.2 DLBCL組患者組織miR-125表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 DLBCL組患者組織miR-125表達(dá)水平與性別、年齡、原發(fā)部位、體能狀況評(píng)分、B癥狀無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)，免疫表型為非生發(fā)中心來(lái)源、Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、乳酸脫氫酶>245 U/L、IPI評(píng)分3～5分、結(jié)外累及≥2處、Ki-67指數(shù)≥75%的DLBCL患者miR-125表達(dá)水平更高(P<0.05,表1)。

表1 DLBCL組患者組織miR-125表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 DLBCL組患者miR-125表達(dá)水平影響因素分析 納入單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)據(jù)進(jìn)入多因素回歸方程進(jìn)行賦值，結(jié)果顯示，免疫表型、乳酸脫氫酶水平、IPI評(píng)分與Ki-67指數(shù)均為miR-125表達(dá)相關(guān)影響因素(P<0.05)，免疫表型為非生發(fā)中心來(lái)源、乳酸脫氫酶水平越高、IPI評(píng)分越高、Ki-67指數(shù)越高，組織miR-125表達(dá)越高，表2。

表2 DLBCL組患者miR-125表達(dá)水平影響因素分析

2.4 DLBCL組患者miR-125表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響 按miR-125表達(dá)水平高低分為低miR-125表達(dá)組(miR-125<4.00，n=78)與高miR-125表達(dá)組(miR-125≥4.00，n=70)，低miR-125表達(dá)組出現(xiàn)隨訪期間死亡2例，總生存率為97.4%，中位生存時(shí)間為36.30個(gè)月；高miR-125表達(dá)組隨訪期間死亡16例，總生存率為77.1%，中位生存時(shí)間為33.67個(gè)月，兩組生存情況比較(LogRankχ2=4.488，P=0.034<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 不同miR-125表達(dá)DLBCL患者生存曲線比較

3 討論

DLBCL高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，大多侵襲性較強(qiáng)[11]。以往多通過(guò)腫瘤形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類，但與患者病情進(jìn)展、預(yù)后無(wú)明顯關(guān)聯(lián)[12-13]。目前，多依據(jù)腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜及免疫組化特征將其分為生發(fā)中心來(lái)源與非生發(fā)中心來(lái)源，一般后者預(yù)后更差[14]。但最新報(bào)道發(fā)現(xiàn)，仍有較大一部分生發(fā)中心來(lái)源DLBCL患者病情緩解后可能復(fù)發(fā)或?qū)χ委煙o(wú)明顯反應(yīng)性，預(yù)后不理想[15]。以往IPI評(píng)分常被用于預(yù)測(cè)DLBCL預(yù)后，但劉宜平等[16]發(fā)現(xiàn)，相同IPI評(píng)分患者仍存在不同預(yù)后，該觀點(diǎn)認(rèn)為，IPI評(píng)分尚無(wú)法完全反映DLBCL患者異質(zhì)性特征。

miR-125是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病及進(jìn)展高度相關(guān)的小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125在多種血液系統(tǒng)腫瘤均可見(jiàn)異常表達(dá)，且其作用存在差異[17-18]。Baraniskin等[19]研究顯示，在慢性淋巴細(xì)胞白血病及多發(fā)性骨髓瘤患者中miR-125存在典型抑癌作用。而在急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病中存在典型癌基因作用[20]。但對(duì)DLBCL發(fā)病過(guò)程中miR-125的作用尚未完全明確。張文婷等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-125在DLBCL復(fù)發(fā)或進(jìn)展時(shí)表達(dá)異常改變，高miR-125表達(dá)水平通常提示更短的生存時(shí)間。本研究留取DLBCL患者組織標(biāo)本，并與RH對(duì)照，發(fā)現(xiàn)DLBCL患者組織miR-125表達(dá)較RH明顯上升，支撐闕喜妹等[22]研究結(jié)論，提示miR-125在DLBCL發(fā)病過(guò)程中存在癌基因作用，參與DLBCL發(fā)病過(guò)程。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，免疫表型、IPI評(píng)分、Ki-67指數(shù)均影響DLBCL患者miR-125表達(dá)，提示miR-125對(duì)區(qū)分DLBCL免疫表型，評(píng)估預(yù)后存在價(jià)值。分析原因可能為：miR-125上調(diào)可能促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子κ-輕鏈增強(qiáng)，活化下游靶基因，促進(jìn)DLBCL發(fā)生及進(jìn)展，在DLBCL發(fā)病中存在誘導(dǎo)及觸發(fā)作用[23]。同時(shí)miR-125參與細(xì)胞分化、增殖及代謝等構(gòu)成，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄水平，影響腫瘤生物學(xué)行為，推測(cè)高miR-125表達(dá)通過(guò)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞惡性表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致DLBCL進(jìn)展，并影響其預(yù)后。王韋婷等[24]認(rèn)為血清乳酸脫氫酶影響NHL患者預(yù)后，高乳酸脫氫酶患者預(yù)后更差。本研究發(fā)現(xiàn)在DLBCL患者中存在相似結(jié)果，且DLBCL患者乳酸脫氫酶表達(dá)對(duì)miR-125水平存在影響，推測(cè)兩者均參與DCBCL發(fā)病過(guò)程，對(duì)預(yù)后有一定影響，但尚需進(jìn)一步展開(kāi)分子機(jī)制研究證實(shí)。而miR-125與DLBCL結(jié)外累及范圍、臨床分期等無(wú)關(guān)，支撐曹迪等[25]結(jié)論，考慮臨床分期主要依據(jù)病變累及部位及范圍劃分，而miR-125與DLBCL病變受累范圍及部位無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125高表達(dá)血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者OS更短[26]。本研究所有患者均完成3年隨訪調(diào)查，隨訪截止日miR-125低表達(dá)患者中位OS為36.30個(gè)月，而高表達(dá)miR-125中位OS為33.67個(gè)月，miR-125高表達(dá)患者隨訪結(jié)束總生存率低于低表達(dá)患者，這與Nakayama等[27]統(tǒng)計(jì)的5年生存率明顯差異存在相似結(jié)論，進(jìn)一步證實(shí)高miR-125表達(dá)的DLBCL患者生存預(yù)后更差。

綜上，本研究認(rèn)為，DLBCL患者組織miR-125呈明顯高表達(dá)，與患者免疫表型、乳酸脫氫酶水平、IPI評(píng)分、Ki-67指數(shù)有關(guān)，對(duì)患者預(yù)后存在一定的影響，高表達(dá)miR-125提示更短的生存期。推測(cè)高表達(dá)miR-125可能通過(guò)影響免疫表型、乳酸脫氫酶水平及Ki-67指數(shù)等參與DLBCL發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程，但對(duì)其確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究論證。