楊澤福，萬建平，潘 偉，薛世榮，楊 玲

心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是心臟冠狀動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致的急性心肌壞死，常伴隨心臟重構(gòu)性修復(fù)后心肌纖維化(Myocardial fibrosis，MF)[1-2]。MF是MI后有助于心臟重塑的一種重要的病理過程和發(fā)病機(jī)制[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有65%的MI患者表現(xiàn)有MF性心臟重構(gòu)[4]。因而限制MI后的纖維化對(duì)預(yù)防和治療心臟病尤為重要。

在正常情況下，心臟成纖維細(xì)胞保持相對(duì)生長靜止，分泌適量的膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)以維持心臟的結(jié)構(gòu)完整性和正常功能。當(dāng)發(fā)生MI，心臟成纖維細(xì)胞被激活，其增殖并分化為高表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致纖維化心肌中過多的I型膠原蛋白等ECM沉積，引起心臟重構(gòu)。因此，抑制心臟成纖維細(xì)胞激活及分泌膠原蛋白等ECM合成是治療MI后MF的重要靶點(diǎn)。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一類小型非編碼RNA，因其對(duì)基因表達(dá)的負(fù)面調(diào)控而備受關(guān)注[5]。miRNA通過互補(bǔ)序列與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)域結(jié)合導(dǎo)致翻譯抑制，影響細(xì)胞增殖凋亡，可以作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床疾病診斷和治療[4,6-7]中，肝纖維化小鼠高表達(dá)miR-125a參與調(diào)控肝星狀細(xì)胞細(xì)胞增殖和活化調(diào)控[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a具有調(diào)控Notch信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡[9-12]。且Notch信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)之間存在相關(guān)作用[13]。然而miR-125a是否調(diào)控Notch1信號(hào)傳導(dǎo)以調(diào)節(jié)MF尚不明確。

因此，本研究旨在分析MI后MF患者臨床特點(diǎn)與miR-125a的關(guān)系，并研究miR-125a是否通過調(diào)控Notch1蛋白參與調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞增殖凋亡及其活化，為miR-125a在MI后MF的干預(yù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年10月-2018年10月佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院235例MI患者，其中115例為MF患者組，120例為非MF患者組，整理分析性別比例、BMI、高血壓、糖尿病等危險(xiǎn)因子信息，同時(shí)分析患者心電圖特征，收集外周血并分離血漿后與病變組織共同凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 切片染色分析和組織羥脯氨酸含量檢測(cè) 取患者心臟組織50 mg，依據(jù)試劑盒(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)說明書，進(jìn)行羥脯氨酸含量檢測(cè)。用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)包埋、切片后，標(biāo)準(zhǔn)脫蠟、水化后進(jìn)行Masson染色，封片并拍照。切片經(jīng)檸檬酸鹽溶液修復(fù)后，5%人血清封閉1 h，孵育α-SMA(1∶250,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、Ⅰ型膠原(1∶200，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)4 ℃ 12 h，PBST漂洗3次，CY3標(biāo)記兔抗人二抗(1∶500，武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)室溫1 h并依據(jù)兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)操作進(jìn)行免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)。采用Image-Pro Plus 6.0分析其染色面積。

1.2.2 原代心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 取人心臟組織100 mg，剪碎后加入1 g/L胰酶(Thermo Fisher公司,美國)和0.8 g/L膠原酶Ⅳ(Thermo Fisher公司,美國)，4 ℃消化30 min，加入10%胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司)的Dulbecco的改性Eagle營養(yǎng)混合物F-12培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司,美國)，用100目細(xì)胞過濾篩子過濾混合液，離心收集沉淀，接種于10 mm培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，采用α-SMA和Vimentin(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)鑒定心臟成纖維細(xì)胞。

1.2.3 CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取第3代原代心臟成纖維細(xì)胞，每孔5 000個(gè)接種96孔培養(yǎng)板中，24 h后加入40 μmol/L的miR-125a抑制劑(廣州銳博生物科技有限公司)和lipo2000(Thermo Fisher公司,美國)混合液處理于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、12、24、48和72 h后，加入CCK-8溶液(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)37 ℃孵育1 h，采用酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國)測(cè)定450 nm的吸光值(OD450)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以0 h為100%增殖率作參照計(jì)算增殖率。

1.2.4 Annexin Ⅴ/PI雙標(biāo)法和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取第3代原代心臟成纖維細(xì)胞，每孔2.5×106個(gè)接種6孔培養(yǎng)板中，24 h后加入40 μmol/L的miR-125a抑制劑和lipo2000混合液處理24 h，使用1 μg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)染色后利用熒光顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，通過形態(tài)學(xué)變化評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，以無酶消化液(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，加Annexin Ⅴ-FITC(Ebioscience，美國)和PI各1 μL，4 ℃孵育30 min，離心漂洗后，以200 mL PBS重懸后，在流式細(xì)胞儀(ACEA，美國)測(cè)定早期凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 取第3代原代心臟成纖維細(xì)胞，每孔2.5×105個(gè)接種24孔培養(yǎng)板中，24 h后加入0、20、40、60、80和100 μmol/L的miR-125a抑制劑和lipo2000混合液處理，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，12孔板接種細(xì)胞加入20 ng/mL的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(武漢羅德生物科技有限公司)處理6 h后，轉(zhuǎn)染40 μmol/L miR-125a抑制劑24 h，收集細(xì)胞加入含磷酸化酶抑制劑(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)和Cocktail的RIPA總蛋白裂解液(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)60 mL，冰上裂解20 min，細(xì)胞刮收集至1.5 mL EP管，超聲破碎，10 000×g、4 ℃離心20 min,取上清液至1.5 mL EP管，以BCA試劑盒(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)蛋白濃度，各組取20 mg蛋白，熱變性后于10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h后封閉，加入一抗(Notch1、α-SMA、CollagenⅠ和Smad2/3稀釋比為1∶1 000，p-Smad2/3稀釋比為1∶500(R&D公司，美國)；GAPDH稀釋比為1∶2 500(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，4 ℃過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記二抗(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)室溫下作用1 h后ECL顯影曝光(Bio-Rad，美國)。以ImageJ分析條帶灰度值，統(tǒng)計(jì)分析蛋白的表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-125a表達(dá) 收集患者血漿和組織，按照Trizol一步提取試劑盒(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)提取總RNA并使用NanoDrop2000對(duì)RNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。參照第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher公司,美國)操作步驟將300 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取10 ng cDNA作模版，10 μL qRT-PCR反應(yīng)體系,SYBGreenⅠ染料(TaKaRa，中國)檢測(cè)miR-125a水平，反應(yīng)程序：95 ℃、3 min，95 ℃、5s，60 ℃、30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-125a相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本復(fù)孔3個(gè)，產(chǎn)物用含Goldview(武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司)的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 MI后MF患者臨床特征分析 本研究中MI后MF患者與MI后非MF患者相比，無明顯年齡、性別、BMI和高血壓等危險(xiǎn)因子顯著性差別，表1。

表1 兩組患者的臨床特征

2.2 MI后MF患者心臟重構(gòu)和ECM檢測(cè) MI后MF患者心臟組織羥脯氨酸、α-SMA和CollagenⅠ含量顯著高于MI后非MF患者，Masson染色顯示，其心臟組織重構(gòu)明顯高于MI后非MF患者，圖1。

圖1 MI后MF的ECM特征與MI后非MF比較，*P<0.05

2.3 MI后MF患者的超聲心電圖特征分析 MI后MF患者與非MF患者相比，心率、每搏輸出量、分?jǐn)?shù)縮短、心輸出量CO和心臟指數(shù)無明顯的變化，左心室收縮壓顯著升高和舒張壓顯著降低，收縮末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)、舒張期末室間隔厚度和左室后壁厚度顯著升高，表2。

表2 兩組患者的超聲心電圖表征

2.4 MI后MF患者miR-125a含量檢測(cè) MI后MF患者與非MF患者相比，外周血和組織中miR-125a含量顯著升高，圖2。

圖2 miR125a在MI后MF中表達(dá)上調(diào)與MI后非MF比較，***P<0.001

2.5 miR-125a含量與心功能和纖維化相關(guān)性 MI后MF患者顯著升高的miR-125a含量與左心室收縮壓、收縮末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)顯著正相關(guān)，與左心室舒張壓呈顯著負(fù)相關(guān)。與心臟組織HYP、α-SMA和CollagenⅠ含量呈顯著正相關(guān)，表3。

表3 miR-125a與心功能和纖維化相關(guān)分析

2.6 miR-125a對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)的影響 40、60、80、100 μmol/L的miR-125a抑制劑組miR-125a表達(dá)量明顯低于0濃度的miR-125a抑制劑組，Notch1蛋白表達(dá)量明顯高于0濃度的miR-125a抑制劑組，同時(shí)具有劑量依賴性，圖3。

圖3 miR-125a抑制劑下調(diào)心肌成纖維細(xì)胞miR-125a和上調(diào)Notch1蛋白表達(dá)與0 濃度組比較，*P<0.05

2.7 miR-125抑制劑對(duì)原代心肌成纖維細(xì)胞增殖和凋亡影響 40 μmol/L的miR-125a抑制劑處理組細(xì)胞增殖率在24、48和72 h明顯低于40 μmol/LmiR-NC組(對(duì)照組)，且具有時(shí)間依賴性。在24 h，其細(xì)胞核固縮和Annexin Ⅴ+PI-細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組水平，圖4。

圖4 miR-125a抑制劑抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001

2.8 miR-125抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-βb1激活的原代心肌成纖維細(xì)胞Notch1、p-Smad2/3、α-SMA和CollagenⅠ蛋白影響 轉(zhuǎn)化生長因子-β1和40 μmol/L的miR-125a抑制劑聯(lián)合處理組的Notch1明顯高于轉(zhuǎn)化生長因子-βb1和40 μmol/L的miR-NC聯(lián)合處理對(duì)照組，p-Smad2/3、α-SMA和CollagenⅠ蛋白含量明顯低于轉(zhuǎn)化生長因子-β1和40 μmol/L的miR-NC聯(lián)合處理對(duì)照組，圖5。

圖5 miR-125a抑制劑抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1激活的心臟成纖維細(xì)胞中的Notch1，p-Smad2/3，α-SMA和Collagen Ⅰ表達(dá)與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

MI后MF是心臟功能障礙和死亡的主要原因[14]。心臟成纖維細(xì)胞增殖激活是MF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵過程[15-16]。明確心臟成纖維細(xì)胞增殖和激活的機(jī)制將為MF相關(guān)心臟病變的預(yù)防和治療提供重要線索。

miRNAs在多種類型疾病中發(fā)揮著預(yù)防、調(diào)控與預(yù)測(cè)病程的作用[5]。本研究中，首先通過對(duì)MI后非MF和MF患者血漿以及組織中miR-125a表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，MF患者高表達(dá)miR-125a，提示其可能參與MF的發(fā)生發(fā)展。這與文獻(xiàn)中報(bào)道m(xù)iR-125a調(diào)控纖維化病變相符[8]。其次，本研究分析了其與心電圖特征和ECM含量關(guān)系，證實(shí)其顯著相關(guān)，從而證明其可能作為MF的治療和監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物，是否真的對(duì)病程有一定的指示仍有待進(jìn)一步證實(shí)。Notch信號(hào)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖激活并介導(dǎo)MF[13]。然而，miR-125a是否調(diào)控二者尚不明確。早期研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的新生大鼠心臟CMT中Notch1表達(dá)下調(diào)[17]。此外，成年小鼠的應(yīng)激心臟中的Notch活化抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)CMT和MF。為了闡明miR-125a是否調(diào)節(jié)Notch1和轉(zhuǎn)化生長因-β1/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)參與MF形成[18]。本研究檢測(cè)了miR-125a抑制劑對(duì)人原代心臟成纖維細(xì)胞增殖凋亡和活化的影響，結(jié)果顯示，miR-125a抑制劑具有時(shí)間依賴性，抑制人原代心臟成纖維細(xì)胞增殖的作用，且可促進(jìn)凋亡。同時(shí)具有阻斷轉(zhuǎn)化生長因子-β1激活的心臟成纖維細(xì)胞分泌膠原等ECM的作用。因此，miR-125a參與調(diào)控人原代心臟成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及其活化和分泌ECM。

總之，使用MI后MF患者血液和組織及轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的人原代心臟成纖維細(xì)胞激活模型，本研究證明miR-125a通過調(diào)控Notch1信號(hào)參與心臟成纖維細(xì)胞激活和增殖凋亡。miR-125a是否具有調(diào)控其他信號(hào)蛋白及Notch信號(hào)及其下游信號(hào)分子如何參與MF仍需要進(jìn)一步研究。