趙志煌 洪 潔 陳豪燕 鐘 鳴

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科1(200127) 消化內(nèi)科2

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)最新全球癌癥估算數(shù)據(jù)，2020年全球約有193萬例新發(fā)CRC病例和93萬例CRC相關(guān)死亡病例，分居全球癌癥發(fā)病和死因的第三位(10.0%)和第二位(9.4%)[1]。我國(guó)CRC總體發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分居第三和第五位，且呈逐年上升趨勢(shì)[2-3]。目前，CRC相關(guān)死亡的主要原因仍為腫瘤轉(zhuǎn)移，因轉(zhuǎn)移死亡的人數(shù)分別占初診和確診人數(shù)的25%和50%[4-6]。對(duì)于CRC轉(zhuǎn)移患者，手術(shù)切除仍為最佳治療方案，但術(shù)后復(fù)發(fā)現(xiàn)象常見[7]。因此，對(duì)CRC轉(zhuǎn)移機(jī)制及其早期診斷分子標(biāo)志物的研究顯得尤為重要。

Fibulin蛋白家族是一類廣泛表達(dá)于各類組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白，其表達(dá)改變?cè)谀[瘤進(jìn)展，尤其是侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[8-12]，但具體作用機(jī)制尚未完全明確。本課題組的前期篩選研究發(fā)現(xiàn)，ECM功能在轉(zhuǎn)移性CRC中有高度富集，同樣提示了ECM在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用。同時(shí)，本課題組還發(fā)現(xiàn)，fibulin-2(FBLN2)高表達(dá)的CRC患者無病生存期(disease free survival, DFS)較FBLN2低表達(dá)者明顯縮短?；贔BLN2可能參與CRC侵襲、轉(zhuǎn)移的假設(shè)，本研究分析了FBLN2在CRC中的表達(dá)情況，并探討其對(duì)CRC侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響和可能的作用機(jī)制，以期為CRC轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療提供新靶點(diǎn)。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人CRC細(xì)胞株HCT116、HT29、RKO、DLD-1、SW480、SW1116、LOVO、SW620以及人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞株FHC均購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫(kù)。

DharmaFECTTM轉(zhuǎn)染試劑(GE Healthcare)；FBLN2 siRNA和對(duì)照siRNA(siRNA-ctrl)序列見表1(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；FBLN2過表達(dá)質(zhì)粒FBLN2-pcDNA3.1和對(duì)照質(zhì)粒ctrl-pcDNA3.1(吉?jiǎng)P基因)；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Transwell小室(Millipore?, Merck KGaA)；BD MatrigelTM基底膜基質(zhì)(BD Biosciences)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱreal-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.)；PCR引物[金斯瑞生物科技(南京)有限公司]；兔GAPDH、FBLN2多克隆抗體(Abcam plc.)；兔上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin, CDH1)、神經(jīng)鈣黏著蛋白(N-cadherin, CDH2)、鋅指家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1(Snail family transcriptional repressor 1, Snai1)、鋅指家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2(Snail family transcriptional repressor 2, Snai2/SLUG)、波形蛋白(vimentin, VIM)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)單克隆抗體(Cell Signaling Tech-nology, Inc.)。

表1 FBLN2 siRNA和對(duì)照siRNA序列

二、方法

1. 公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析：從Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取PRJNA218851數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括18例CRC患者的正常結(jié)腸黏膜、CRC原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶共54個(gè)樣本的RNA序列數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫(kù)信息提取采用R3.6.1軟件，以篩選與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。

從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取COAD(colon adenocarcinoma)隊(duì)列和READ(rectum adenocarcinoma)隊(duì)列中625例CRC組織芯片數(shù)據(jù)，分析FBLN2在CRC組織與正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)差異。根據(jù)FBLN2在CRC組織中表達(dá)量的中位數(shù)，將625例CRC病例分為FBLN2高表達(dá)組和低表達(dá)組。同時(shí)提取上述CRC病例的臨床病理信息，包括初次病理診斷年齡、性別、美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC) TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等以及預(yù)后信息，分析FBLN2表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。組織芯片信息采用R3.6.1軟件提取。

除SRA、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)外，本研究使用的公共數(shù)據(jù)庫(kù)還包括基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Genotype-Tissue Expression, GTEx; http://gtexportal.org/home/)和高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, GEO; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)GSE39582數(shù)據(jù)集。GTEx系對(duì)來自人體多個(gè)組織和器官的樣本同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因型分析所構(gòu)建的組織特異性基因表達(dá)和調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。

Metascape(http://metascape.org/)是一個(gè)功能強(qiáng)大的基因功能注釋分析工具，整合了GO、KEGG、UniProt等多個(gè)權(quán)威功能數(shù)據(jù)庫(kù)，可在線將當(dāng)前主要的生物信息學(xué)分析方法應(yīng)用于批量基因和蛋白質(zhì)的分析中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因和蛋白質(zhì)功能的認(rèn)知。

基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA； http://gepia2.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)可基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)提供快速且可自定義的功能，包括差異表達(dá)分析、生存分析、相似基因檢測(cè)等，用于分析FBLN2在CRC組織中的異常表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性。

2. 臨床組織樣本收集和信息采集：臨床CRC組織樣本來源于在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院普外科接受外科手術(shù)治療的CRC患者，于癌組織中央非壞死區(qū)域取材(癌旁組織標(biāo)本于距癌組織邊緣1～3 cm處腸黏膜取材)，由2名高年資消化病理醫(yī)師診斷為CRC。采集患者臨床病理信息。樣本收集和信息采集符合醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。

3. CRC細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：CRC細(xì)胞使用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基或RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d換液一次，每3 d長(zhǎng)至80%左右傳代。細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，以(2～3)×105/孔接種于 6 孔板，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)穩(wěn)定后，參照轉(zhuǎn)染試劑說明，以siRNA-ctrl、FBLN2 siRNA轉(zhuǎn)染LOVO、SW620細(xì)胞，以對(duì)照質(zhì)粒ctrl-pcDNA3.1、FBLN2過表達(dá)質(zhì)粒FBLN2-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染HCT116、HT29細(xì)胞，并將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)基換回完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取總RNA，72 h后提取總蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4. CCK-8實(shí)驗(yàn)：分別于轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒后的第0、1、2、3、4、5天消化LOVO細(xì)胞或HCT116細(xì)胞，重懸、計(jì)數(shù)，每孔加入100 μL含10% CCK-8試劑的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)。

5. 克隆形成實(shí)驗(yàn)：將LOVO、HCT116細(xì)胞以800～1 000/孔接種于6 孔板，按上述方法轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3 d換液一次，7～10 d后棄去培養(yǎng)基，固定染色后拍照，觀察、計(jì)數(shù)克隆形成大小和數(shù)量。

6. Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染siRNAs的LOVO、SW620細(xì)胞和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HCT116、HT29細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后消化，以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸。將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中，鋪入40 μL Matrigel；4～6 h后在小室下層加入600 μL含 20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，上層加入200 μL上述細(xì)胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后取出小室，固定染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。隨機(jī)選取3個(gè)視野(放大 40 倍)，計(jì)數(shù)穿過小室的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取均值。

7. Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：LOVO、SW620、HCT116、HT29細(xì)胞處理方式同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中，在小室下層加入1.2 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，上層加入200 μL轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒后的上述細(xì)胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出小室，固定染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。隨機(jī)選取3個(gè)視野(放大40 倍)，計(jì)數(shù)穿過小室的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取均值。

8. 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染siRNAs的LOVO細(xì)胞和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞培養(yǎng)6 h后換回完全培養(yǎng)基繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，以200 μL槍頭在每個(gè)孔中劃一條直線，同時(shí)更換為不含血清培養(yǎng)基，分別于0 h、12 h、24 h在高倍顯微鏡下觀察劃痕生長(zhǎng)情況并拍照。每一時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3個(gè)視野，ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，結(jié)果取均值。

9. Real-time PCR：以PBS洗滌FHC細(xì)胞、8株CRC細(xì)胞株以及轉(zhuǎn)染siRNAs或質(zhì)粒的LOVO、SW620、HCT116、HT29細(xì)胞各2次，同時(shí)將32對(duì)-80 ℃凍存的CRC組織和癌旁組織標(biāo)本研磨成勻漿。參照試劑說明書，以RNAiso Plus提取細(xì)胞或組織總RNA，利用NanoDrop軟件測(cè)定RNA濃度。分別取1 μg上述 RNA，使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min; 85 ℃ 5 s; 4 ℃循環(huán))，以之為模板，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ real-time PCR試劑盒，在Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR系統(tǒng)中行real-time PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s; 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))，引物序列見表2。2- △△ CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

表2 Real-time PCR引物序列

10. 蛋白質(zhì)印跡法：6孔板中的細(xì)胞以PBS洗滌3次，冰上裂解，收集細(xì)胞裂解液，離心后吸取上清液，BCA法蛋白定量。配制10% SDS-PAGE，蛋白上樣，70 V電泳30 min，125 V 電泳60 min，100 V PVDF膜轉(zhuǎn)膜120 min。室溫牛血清蛋白搖床封閉 2 h，分別加入各一抗(FBLN2: 1∶500稀釋，其他均為1∶1 000稀釋)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱孵育過夜，隔日搖床充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，充分洗滌后加入ECL發(fā)光液，曝光，數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描圖像。

11. 免疫組化染色：制備259例臨床CRC組織的石蠟組織芯片，脫蠟、水化、檸檬酸鹽微波抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加FBLN2抗體(1∶200稀釋)，4 ℃冰箱過夜，隔日滴加酶標(biāo)羊抗兔IgG，滴加顯色劑、核染、水洗、封片。高倍成像顯微鏡下以圖像采集軟件采集圖像，由2名病理醫(yī)師判讀并評(píng)分。免疫反應(yīng)評(píng)分(immuno-reactive score, IRS)：染色面積0～25%、25%～50%、50%～75%、>75%分別計(jì)1、2、3、4分，染色強(qiáng)度弱(淺棕色)、中等(棕黃色)、強(qiáng)(深棕色)分別計(jì)1、2、3分，總分為染色面積與染色強(qiáng)度得分的乘積。IRS評(píng)分分級(jí)：1級(jí)，1、2分；2級(jí)，3、4分；3級(jí)，6、8分；4 級(jí)：9、12分。IRS 1、2級(jí)判定為FBLN2低表達(dá)，3、4級(jí)判定為FBLN2高表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因篩選和通路富集分析

比較SRA數(shù)據(jù)庫(kù)PRJNA218851數(shù)據(jù)集中18對(duì)匹配的CRC原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以log2(fold change)>2 (P<0.05)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出313個(gè)在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)顯著上調(diào)的基因；將上調(diào)基因列表上傳至Metascape進(jìn)行在線分析，富集得到的最顯著的前2個(gè)通路均與ECM有關(guān)(圖1A)。經(jīng)查閱ECM與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的文獻(xiàn)，本課題組將研究目標(biāo)鎖定于fibulin蛋白家族。

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的625例CRC組織芯片數(shù)據(jù)，以GEPIA網(wǎng)絡(luò)分析工具分析fibulin蛋白家族成員與CRC患者的DFS是否相關(guān)，結(jié)果顯示僅FBLN2高表達(dá)組DFS明顯短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)，提示FBLN2可能在CRC中發(fā)揮作用。故本研究將FBLN2作為研究對(duì)象。

A：Metascape功能富集分析(數(shù)據(jù)來源：SRA數(shù)據(jù)庫(kù))；B：FBLN2表達(dá)與CRC預(yù)后分析(數(shù)據(jù)來源：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))

二、FBLN2在CRC組織中的表達(dá)及其與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系

首先利用GEPIA網(wǎng)絡(luò)分析工具分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)COAD、READ隊(duì)列和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中正常結(jié)直腸組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示CRC組織中的FBLN2表達(dá)明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。對(duì)32對(duì)臨床CRC標(biāo)本中FBLN2表達(dá)的檢測(cè)驗(yàn)證了FBLN2在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中625例CRC組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床病理信息進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)T分期為T3-4期的患者FBLN2表達(dá)明顯高于T1-2期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1-2期者FBLN2表達(dá)明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0期)者，N2期患者FBLN2表達(dá)升高更為顯著(圖2C)。對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE39582數(shù)據(jù)集中566例CRC組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床病理信息的相關(guān)性分析結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果趨勢(shì)相同(圖2D)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)BLN2在CRC組織中的表達(dá)較正常組織降低，但在局部進(jìn)展期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織中表達(dá)升高，提示FBLN2可能在CRC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證FBLN2與CRC的相關(guān)性，對(duì)259例臨床CRC組織制成的組織芯片進(jìn)行FBLN2免疫組化染色(圖2E)，結(jié)果顯示FBLN2 IRS高分者的比例隨TNM分期的增高而增高(圖2F)。FBLN2表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)；與FBLN2低表達(dá)組(IRS<6分)相比，F(xiàn)BLN2高表達(dá)組(IRS≥6分)TNM Ⅲ、Ⅳ期患者更多，且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(表3、圖2F、2G)。比較FBLN2高表達(dá)組與低表達(dá)組的總生存率，結(jié)果顯示前者明顯短于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2H)，與對(duì)TCGA數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致，提示FBLN2表達(dá)與CRC患者的預(yù)后相關(guān)。

表3 CRC患者FBLN2 IRS評(píng)分與臨床病理特征的關(guān)系

組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns：P>0.05

三、FBLN2在CRC細(xì)胞株中的表達(dá)情況以及敲低、過表達(dá)效率

通過比較FBLN2在8株常用CRC細(xì)胞株和正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞株FHC中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FBLN2在CRC細(xì)胞株中的表達(dá)均顯著降低，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在具有高轉(zhuǎn)移性的LOVO和SW620細(xì)胞中，F(xiàn)BLN2表達(dá)較其他CRC細(xì)胞株明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。予LOVO、SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染FBLN2 siRNA，F(xiàn)BLN2表達(dá)顯著降低(圖3B)；予FBLN2表達(dá)較低的HCT116、HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染FBLN2-pcDNA3.1，F(xiàn)BLN2表達(dá)顯著升高(圖3C)。

組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns：P>0.05

四、FBLN2對(duì)CRC細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響

選擇FBLN2表達(dá)較高的LOVO、SW620細(xì)胞和FBLN2表達(dá)較低的HCT116、HT29細(xì)胞進(jìn)行此部分實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染FBLN2 siRNA的LOVO細(xì)胞與轉(zhuǎn)染siRNA-ctrl者相比增殖能力無明顯差異(圖4A)；轉(zhuǎn)染FBLN2-pcDNA3.1質(zhì)粒的HCT116細(xì)胞與轉(zhuǎn)染ctrl-pcDNA3.1質(zhì)粒者相比增殖能力也無明顯差異(圖4B)。克隆形成實(shí)驗(yàn)同樣顯示，在LOVO細(xì)胞中敲低FBLN2表達(dá)后，克隆形成數(shù)量未見明顯減少(圖4C)；在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)FBLN2后，克隆形成數(shù)量也未見明顯增多(圖4D)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)BLN2對(duì)CRC細(xì)胞的增殖、隆形成能力無明顯影響。

組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns：P>0.05

五、FBLN2對(duì)CRC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

Transwell細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA-ctrl者相比，轉(zhuǎn)染FBLN2 siRNA的LOVO、SW620細(xì)胞在細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(圖5A、5B)；與之相反，轉(zhuǎn)染FBLN2-pcDNA3.1的HCT116、HT29細(xì)胞與轉(zhuǎn)染ctrl-pcDNA3.1者相比，穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量均明顯增多(圖5C、5D)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)同樣顯示，敲低FBLN2表達(dá)的LOVO細(xì)胞劃痕愈合速度明顯減慢(圖5E)，而過表達(dá)FBLN2的HCT116細(xì)胞劃痕愈合速度明顯加快(圖5F)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)BLN2可增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

A、C：Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(鋪Matrigel基底膜基質(zhì))；B、D：Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(不鋪基底膜基質(zhì))；E、F：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

六、FBLN2下游信號(hào)通路的分析和驗(yàn)證

為進(jìn)一步探究FBLN2影響CRC侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的625例CRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)FBLN2高表達(dá)組與低表達(dá)組間的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因集富集分析，包括HALLMARK基因集和KEGG基因集，富集分?jǐn)?shù)(ES)最高的是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)通路(圖6)，由此推測(cè)FBLN2可能通過激活EMT通路促進(jìn)CRC侵襲、轉(zhuǎn)移。

數(shù)據(jù)來源：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)COADREAD隊(duì)列，F(xiàn)BLN2低表達(dá)組312例，F(xiàn)BLN2高表達(dá)組312例

為驗(yàn)證FBLN2表達(dá)與EMT通路的相關(guān)性，予LOVO、SW620細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA-ctrl和FBLN2 siRNA，結(jié)果顯示敲低FBLN2表達(dá)后，EMT通路關(guān)鍵分子CDH2、Snai1、Snai2/SLUG、VIM表達(dá)明顯降低，CDH1、ZO-1表達(dá)明顯升高(圖7A)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)CRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的FBLN2表達(dá)與EMT通路分子表達(dá)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FBLN2與CDH2、Snai1、VIM表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(圖7B)，進(jìn)一步驗(yàn)證了FBLN2與EMT通路間的相關(guān)性，提示FBLN2促進(jìn) CRC侵襲、轉(zhuǎn)移可能與激活EMT通路有關(guān)。

組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns：P>0.05

討 論

我國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，CRC的發(fā)病率和死亡率在主要癌癥中均居前列且呈逐年上升趨勢(shì)[2-3]。目前CRC患者死亡的主要原因仍為腫瘤轉(zhuǎn)移[4-6]，但尚缺乏足夠的能有效預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移發(fā)生的分子標(biāo)志物。文獻(xiàn)資料顯示，近50%的CRC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，約25%的患者確診時(shí)即合并肝轉(zhuǎn)移[5]。未經(jīng)治療的肝轉(zhuǎn)移患者中位生存期僅為6.9個(gè)月，轉(zhuǎn)移灶無法手術(shù)切除者5年生存率低于5%，而肝轉(zhuǎn)移灶完全切除者的中位生存期為35個(gè)月，5年生存率為30%～57%[13-16]。因此，及時(shí)篩查并發(fā)現(xiàn)發(fā)生轉(zhuǎn)移的CRC患者并予綜合治療對(duì)于改善其預(yù)后至關(guān)重要。針對(duì)CRC轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期篩查，以及尋找有效的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物成為近年來CRC防治研究的重點(diǎn)之一。

ECM系指細(xì)胞周圍由多種大分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對(duì)于生理狀態(tài)下細(xì)胞外穩(wěn)態(tài)的維持以及腫瘤細(xì)胞的侵襲、播散均起有重要作用。本研究通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)CRC基因表達(dá)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ECM蛋白FBLN2可能是促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，其在CRC細(xì)胞和組織中均呈低表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移性CRC中，其表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移性CRC，且對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床組織芯片數(shù)據(jù)的分析均顯示FBLN2表達(dá)隨CRC進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及臨床分期的升高而升高，并與不良預(yù)后相關(guān)，提示FBLN2可能是在CRC進(jìn)展后期和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子。同時(shí)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中敲低FBLN2表達(dá)并不影響CRC細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，但可顯著降低其侵襲和遷移能力，推測(cè)FBLN2在CRC腫瘤形成和維持腫瘤細(xì)胞增殖性方面的作用較弱，但隨著病情的進(jìn)展，其表達(dá)激活可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括ECM降解、腫瘤細(xì)胞間的黏附性降低、腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮間的黏附性增強(qiáng)以及腫瘤微環(huán)境改變等[17-19]。EMT系指上皮細(xì)胞在某些細(xì)胞因子的作用下失去上皮特征而獲得間質(zhì)特征的過程，間質(zhì)特性的獲得可使腫瘤細(xì)胞更具運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[20]。研究表明，EMT與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等惡性行為均具有密切聯(lián)系，是大部分類型的惡性腫瘤惡性演進(jìn)過程中的重要環(huán)節(jié)[20-24]。EMT的發(fā)生與特定微環(huán)境密切相關(guān)，腫瘤微環(huán)境中存在大量基質(zhì)細(xì)胞、ECM蛋白、信號(hào)分子等，在EMT的發(fā)生中起有關(guān)鍵作用[25-26]。既往研究[9]發(fā)現(xiàn)，fibulin蛋白家族成員FBLN5通過啟動(dòng)和增強(qiáng)EMT參與了乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展過程，由此推測(cè)FBLN2也可能參與了EMT的發(fā)生。

本研究通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC病例基因表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn)受FBLN2表達(dá)改變影響最顯著的通路為EMT通路，提示FBLN2可能通過激活EMT通路增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲、遷移能力，從而促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移，并在細(xì)胞水平驗(yàn)證了FBLN2與EMT通路重要分子標(biāo)志物之間的相關(guān)性，F(xiàn)BLN2參與EMT的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FBLN2可能通過激活EMT通路促進(jìn)CRC侵襲、轉(zhuǎn)移，與腫瘤臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)。FBLN2在CRC中低表達(dá)但在腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)增高的特點(diǎn)，使之可能成為CRC轉(zhuǎn)移早期篩查的分子標(biāo)志物，對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷具有潛在應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)擬針對(duì)FBLN2可能的上游激活信號(hào)分子、FBLN2激活EMT通路的具體機(jī)制及其是否可作為CRC轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)作進(jìn)一步研究。