李 菁 鄒曉平 王鐘晗 高蘇萌 方 榕

南京市中心醫(yī)院消化科1(210018) 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科2 上海市第六人民醫(yī)院消化科3

慢性便秘是老年人常見的消化系統(tǒng)疾病，全球約1/3的老年人長(zhǎng)期受便秘的困擾[1]。我國(guó)總體便秘患病率為3%～11%，60歲以上老年人患病率顯著升高，為15%～20%[2]。慢性便秘患者的生活質(zhì)量明顯下降，且因癥狀持續(xù)影響患者的精神心理狀態(tài)，甚至可能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，如糞便嵌塞、排便失禁、心腦血管疾病發(fā)作、乙狀結(jié)腸扭轉(zhuǎn)等[3]。目前認(rèn)為腸道菌群數(shù)量、種類的改變以及細(xì)菌的代謝分子等均在慢性便秘的發(fā)病過程中起有重要作用。Khalif等[4]的研究發(fā)現(xiàn)成年慢性便秘患者腸道乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著降低。產(chǎn)甲烷菌豐度增加可協(xié)助誘導(dǎo)并加重慢傳輸型便秘[5]。目前尚未見關(guān)于我國(guó)老年慢性便秘患者腸道菌群變化的系統(tǒng)性研究。本研究通過采用16S rRNA檢測(cè)老年慢性便秘患者與健康老年人的腸道菌群，旨在探討老年慢性便秘患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入2019年1月—2019年12月于南京市中心醫(yī)院就診的老年慢性便秘患者30例，其中男性12例，女性18例；年齡60～80歲，平均(71.17±6.81)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥60歲；②符合羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)中慢性便秘診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③排除腸道器質(zhì)性疾病以及內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有惡性腫瘤者；②存在心臟衰竭、腎衰竭者；③有嚴(yán)重未控制的其他疾病或急性感染者；④過去8周內(nèi)接受過抗菌藥物或益生菌治療；⑤患者不能理解研究目的或不同意研究的要求。以同期30名健康老年人作為對(duì)照，其中男性16名，女性14名；年齡60～79歲，平均(68.43±5.10)歲。入選者均取得知情同意，本研究方案由南京市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

以無菌容器收集入選者晨起第1次糞便15～20 g，2 h內(nèi)置于-80 ℃冰箱中密封保存。提取糞便樣本中微生物基因組，選擇細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物區(qū)包含與測(cè)序儀結(jié)合的P5、P7序列、區(qū)分不同樣本的barcode序列、測(cè)序引物序列、與細(xì)菌16S基因保守區(qū)結(jié)合的序列。用Qiagen膠回收試劑盒，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，并用NanoDrop和Qubit分別進(jìn)行文庫定量。按照每個(gè)樣品10萬條測(cè)序序列(reads)的數(shù)據(jù)量，加入合適的文庫量，選擇NextSeq CN500進(jìn)行PE150測(cè)序。原始下機(jī)數(shù)據(jù)首先采用FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，得到有效序列后進(jìn)行序列拼接，拼接后將其與16S參考數(shù)據(jù)庫作比對(duì)，去除嵌合體序列，將過濾后的序列以97%相似度的序列組成一類操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)，1個(gè)OTU代表1個(gè)物種。根據(jù)OTU聚類分析進(jìn)行物種注釋，最后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。上述測(cè)序和生物信息學(xué)分析均由上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。Alpha多樣性分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Beta多樣性分析通過ANOSIM分析比較菌群特征，LEfSe基于線性判別分析(LDA)和STAMP分析評(píng)估組間物種差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、構(gòu)建稀釋曲線

健康組和慢性便秘組所有樣本的稀釋曲線均趨于平坦，曲線平坦說明測(cè)序數(shù)據(jù)合理(圖1)。

圖1 健康組和慢性便秘組所有樣本的稀釋曲線

二、腸道菌群的Alpha多樣性分析

與健康組相比，慢性便秘組Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)均無明顯差異(圖2)。

圖2 慢性便秘組和健康組的Alpha多樣性分析

三、腸道菌群的物種組成分析

慢性便秘組和健康組OTU數(shù)量分別為5 284個(gè)和5 855個(gè)，其中兩組相同的OTU為1 579個(gè)。兩組均獲得優(yōu)勢(shì)菌屬20種，均占所有菌屬的80%以上，其中擬桿菌屬均為豐度最大的菌屬。健康組普雷沃菌屬、糞桿菌屬、毛螺菌屬相對(duì)豐度比例更高；而慢性便秘組瘤胃球菌屬、志賀菌屬、Para-bacteroides、Alistipes相對(duì)豐度比例更高(圖3)。

圖3 健康組和慢性便秘組腸道菌群屬水平分布圖

四、腸道菌群的Beta多樣性分析

使用PCoA的形式展示兩組物種組成之間的接近程度，ANOSIM分析結(jié)果顯示慢性便秘組與健康組的菌群特征相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R=0.098，P=0.001；圖4)。

圖4 健康組和慢性便秘組腸道菌群的PCoA和ANOSIM分析

五、腸道菌群的物種差異分析

采用LEfSe方法篩選出兩組差異顯著的物種,結(jié)果顯示健康組相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的菌群物種有25個(gè)，慢性便秘組有2個(gè)，分別為g_Alistipes、f_Rikenel-laceae(圖5)。健康組和慢性便秘組在≥3個(gè)層級(jí)水平相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的菌群物種分別為4個(gè)和0個(gè)。

圖5 健康組和慢性便秘組顯著差異物種LDA值分布柱狀圖和物種分支進(jìn)化圖

采用STAMP分析兩組腸道菌群屬水平的差異，結(jié)果顯示與健康組相比，慢性便秘組Alistipes、顫螺菌屬、瘤胃球菌屬和Parabacteroides菌屬相對(duì)豐度更高(P<0.05)，巨球型菌屬相對(duì)豐度更低(P<0.05；圖6)。

圖6 健康組和慢性便秘組屬層級(jí)菌種平均比例和差異比較

討 論

腸道菌群是一個(gè)巨大而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其相互制約并相互調(diào)控[7]。腸道菌群與多種疾病相關(guān)，如肥胖、糖尿病、炎癥性腸病、腸易激綜合征、慢性便秘、結(jié)腸腫瘤等[8-9]。腸道菌群可能通過改變數(shù)量和種類、調(diào)整腸道運(yùn)動(dòng)以及免疫調(diào)節(jié)等方面參與慢性便秘的發(fā)病過程[10]。本研究通過納入老年慢性便秘患者與健康老年人，留取糞便進(jìn)行測(cè)序，以期找到兩組人群腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異。

Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和多樣性的指標(biāo)。豐富度包括Ace指數(shù)和Chao指數(shù)，多樣性包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。本研究結(jié)果顯示兩組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無明顯差異，提示老年慢性便秘患者和健康老年人在腸道菌群的種類和數(shù)量以及各自菌群的多樣性方面無明顯差異。進(jìn)一步Beta多樣性分析發(fā)現(xiàn)，兩組腸道菌群組成有明顯差異，兩組中僅1 579個(gè)OTU相同，且PCoA相似性分析結(jié)果顯示兩組的物種組成不相近。在屬層級(jí)水平，兩組前20種優(yōu)勢(shì)菌屬在組成上無差異，但兩組中相同菌屬的相對(duì)豐度比例存在差異，慢性便秘組普雷沃菌屬、糞桿菌屬和毛螺菌屬相對(duì)豐度較健康組減少，而瘤胃球菌屬、志賀菌屬、Parabacteroides、Alistipes相對(duì)豐度則增多。

本研究進(jìn)一步通過LEfSe方法篩選出兩組相對(duì)豐度存在差異的物種，結(jié)果顯示健康組相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的菌群物種有25個(gè)，而慢性便秘組僅2個(gè)，健康組在≥3個(gè)層級(jí)水平相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的菌群物種為4個(gè)；應(yīng)用STAMP分析屬層級(jí)的菌群物種差異，結(jié)果顯示慢性便秘組Alistipes、顫螺菌屬、瘤胃球菌屬和Parabacteroides菌屬相對(duì)豐度顯著高于健康組，而巨球型菌屬相對(duì)豐度更低。

腸道菌群的多樣性是反映腸道微生物穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)，慢性便秘患者腸道菌群數(shù)量以及種類較健康人存在明顯的差異[11]。慢性便秘兒童的糞便菌群多樣性與健康兒童亦不同[9]。有研究指出，老年人的腸道菌群種類和數(shù)量下降[12]。黃林生等[13]的研究發(fā)現(xiàn)慢性功能性便秘患者腸道菌群多樣性與健康組無明顯差異，腸道菌群豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中老年慢性便秘患者的腸道菌群豐度和多樣性與健康老年人相比無明顯差異。兩組菌群種類和數(shù)量無差異可能是老年人菌群種類、數(shù)量下降后在合并便秘情況下無進(jìn)一步顯著下降所致。既往研究顯示成人慢性便秘患者的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬數(shù)量顯著減少[4]，兒童慢性便秘患者雙歧桿菌和梭桿菌數(shù)量未見明顯減少，普雷沃菌屬數(shù)量明顯下降[9]。本研究中兩組菌群物種組成存在明顯差異，但老年慢性便秘患者雙歧桿菌屬無明顯變化，而普雷沃菌屬數(shù)量明顯下降，結(jié)論與兒童便秘患者相同。黃林生等[13]的研究發(fā)現(xiàn)慢性功能性便秘組中Parabacteroides和擬桿菌屬顯著富集；Parthasarathy等[14]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸慢傳輸型便秘患者結(jié)腸黏膜中擬桿菌屬顯著增高。本研究中僅觀察到慢性便秘組Parabacteroides增加。腸道微生態(tài)制劑對(duì)便秘有緩解作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明雙歧桿菌可通過增加便秘小鼠模型腸黏膜5-羥色胺受體4表達(dá)的能力來促進(jìn)腸蠕動(dòng)，從而改善便秘。同時(shí)，雙歧桿菌還可改變腸道菌屬的相對(duì)豐度，為腸道微生態(tài)制劑治療慢性便秘提供了理論依據(jù)[15]。

總之，老年慢性便秘患者腸道菌群的多樣性與健康老年人無差異，而物種組成存在明顯差異。但這些菌群物種的差異在慢性便秘發(fā)病過程中所起的作用目前仍不明確，需行進(jìn)一步的深入研究。如何從這些菌群物種差異中成功找到關(guān)鍵的致病菌群并應(yīng)用于臨床治療老年慢性便秘患者值得進(jìn)一步的研究。