劉珂珂，王 帥，吳愛明，侯雅竹，婁利霞，呂 夢，張冬梅，商洪才

心肌梗死可導(dǎo)致進(jìn)行性心臟功能障礙甚至心力衰竭，具有較高的發(fā)病率和死亡率。在這一病理過程中，心肌細(xì)胞凋亡扮演了重要角色，其可在一定程度上決定梗死范圍的大小，進(jìn)而影響疾病的進(jìn)展[1]。細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡，是一種嚴(yán)格受控的細(xì)胞自殺模式。凋亡能清除衰老及異常細(xì)胞，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但心肌梗死后過度凋亡往往導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量減少，心功能嚴(yán)重受損。抑制心肌細(xì)胞凋亡，可減輕心肌梗死后的心肌損傷，是防治心肌梗死的一種可行策略。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β， TGF-β)可以參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡等生物學(xué)過程。研究表明，TGF-β主要有3種亞型，它們在心肌梗死后受損心肌組織的愈合、修復(fù)過程中表達(dá)均上調(diào)[2]。TGF-β1和TGF-β2在心肌梗死早期即出現(xiàn)上調(diào)，而TGF-β3則是遲發(fā)及長時效上調(diào)[3]。其中，TGF-β1與凋亡的關(guān)系最為密切[4-7]，可通過TGF-β1/Smads信號通路參與細(xì)胞凋亡等多種過程，從而影響心肌梗死的轉(zhuǎn)歸。芪丹利心丸是天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科的專利方，由黃芪、黨參、刺五加、丹參、葶藶子等組成，具有益氣活血利水之功。研究發(fā)現(xiàn)，芪丹利心丸治療心肌梗死的機(jī)制可能與TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)[8]。據(jù)此推測芪丹利心丸可能會對心肌梗死后的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生積極治療作用。因此，本研究從凋亡通路角度研究芪丹利心丸治療心肌梗死的療效及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，健康無特定病原體(SPF)級，體質(zhì)量(180±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要試劑與藥品 戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司，貨號：C06818794)；蘇木精伊紅(HE)染色液(南京建成科技有限公司，貨號：D006)；TGF-β (Abcam公司，貨號：ab92486)；Smad 2、Smad 3(Abcam公司，貨號：ab40855、ab40854)；Bcl-2、Bax(Proteintech公司，貨號：26593-1-Ap、60267-1-Ig)；Caspase-3、Caspase-9 (Abcam公司，貨號：ab184787、ab184786)；凋亡檢測試劑盒(Promega公司，貨號：G3250)。芪丹利心丸由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供(專利號：ZL 201110413471.1)；卡托普利片(每片12.5 mg)由中美上海施貴寶制藥有限公司提供(批號：AAN9869)。

1.3 動物模型制備 參照文獻(xiàn)[9]建立心肌梗死大鼠模型，使用1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后經(jīng)喉氣管插管，心前區(qū)第3肋、第4肋間橫向開胸，在肺動脈圓錐與左心耳下約1 mm處用5/0手術(shù)線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，見到心前區(qū)缺血變白且心電圖ST段抬高，即逐層縫合關(guān)胸，術(shù)后24 h不符合心肌梗死心電圖特征的動物予以剔除。假手術(shù)組操作同模型組，但只穿線不結(jié)扎。

1.4 分組給藥 將造模術(shù)后大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、芪丹利心丸組。芪丹利心丸組與卡托普利組參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行等效劑量換算，相當(dāng)于成人臨床用量的等效劑量。術(shù)后第2天開始，根據(jù)分組情況分別給予芪丹利心丸2.43 g/(kg·d)、卡托普利片2.25 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組給予等體積去離子水，連續(xù)灌胃4周。治療結(jié)束后每組各剩余10只動物。

1.5 HE染色 心肌組織經(jīng)4%的多聚甲醛固定24 h，然后修剪、石蠟包埋、切片、烤片。常規(guī)脫蠟水化后，切片入蘇木素染3～8 min，自來水沖洗，光鏡下觀察，1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)。接著切片入伊紅染液中染色1～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測凋亡相關(guān)通路蛋白的表達(dá) 采用RIPA蛋白裂解法蛋白提取試劑盒提取左心室心肌組織中的總蛋白，冰上裂解45 min，間隔混勻組織液，裂解完成后于4 ℃12 000 g離心25 min，收集上清液，取樣稀釋，采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整所有蛋白樣本使其為相同濃度。SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用5%的脫脂奶粉常溫?fù)u床封閉1 h，加入預(yù)先按說明書稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，以GAPDH為內(nèi)參，TBST清洗后ECL顯色曝光得到蛋白條帶，并使用Image J軟件進(jìn)行條帶分析。

1.7 原位末端標(biāo)記測定(TUNEL)法檢測細(xì)胞凋亡 TUNEL染色按照試劑盒說明書進(jìn)行，充分脫蠟、水化后，室溫平衡10 min，冰上配制反應(yīng)液，37 ℃孵育60 min，終止并用PBS溶液沖洗以去除未加入的熒光素-12-dUTP，在心肌組織上滴一滴含DAPI的抗熒光衰減封片劑，用蓋玻片蓋住玻片并用透明甲油封住邊緣。立即在熒光顯微鏡(A1，ZEISS，德國)下進(jìn)行圖像采集，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)熒光素濾光片，觀察熒光素在520 nm處表示凋亡核的綠色熒光以及在460 nm處藍(lán)色的全核。用Image-Pro Plus 6.0軟件計數(shù)凋亡細(xì)胞核和正常細(xì)胞核的數(shù)目，計算凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠HE染色結(jié)果 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，染色均勻，細(xì)胞核大小形態(tài)基本一致；模型組心肌纖維排列紊亂，局部肌纖維斷裂；與模型組相比，各給藥組均在一定程度上得到改善，心肌纖維排列相對整齊。詳見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色結(jié)果(×400)

2.2 各組大鼠TGF-β1/Smads通路蛋白表達(dá)的比較 與假手術(shù)組比較，模型組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，芪丹利心丸組和卡托普利組TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。詳見圖2。

2.3 各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)，Bax表達(dá)升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；與模型組比較，芪丹利心丸組與卡托普利組Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)，Bax表達(dá)減少(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值增加(P<0.05)。在Caspase凋亡蛋白表達(dá)方面，與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-9和Caspase-3表達(dá)均增加(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，芪丹利心丸組Caspase-9和Caspase-3表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01)，卡托普利組Caspase-9表達(dá)降低(P<0.01)，Caspase-3表達(dá)雖有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖3。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05，＊＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01。圖3 各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(n=3)

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較 與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)增高(P<0.05)；與模型組比較，芪丹利心丸組和卡托普利組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)。詳見圖4。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較(n=10)

3 討 論

心肌梗死是嚴(yán)重的心血管疾病，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率[11-12]。心肌梗死后梗死周圍心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，導(dǎo)致局部心肌細(xì)胞數(shù)目大量減少，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性心功能下降甚至心力衰竭。有研究表明，凋亡細(xì)胞占梗死區(qū)所有丟失細(xì)胞的86%，表明其是導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失的主要原因[13]。而心肌細(xì)胞數(shù)量與心功能密切相關(guān)，因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡對于提高心肌梗死病人的心功能及改善預(yù)后意義重大[14-15]。

中醫(yī)藥在防治心肌梗死方面有著確切的臨床療效[15-16]，其機(jī)制與減輕心肌細(xì)胞凋亡密不可分[17-18]。芪丹利心丸是依據(jù)益氣活血利水治則創(chuàng)制的專利方，近期文獻(xiàn)報道，其能夠調(diào)控TGF-β1的表達(dá)繼而改善心肌梗死后的心肌纖維化[8，19]。目前研究認(rèn)為，TGF-β1的作用十分廣泛，除調(diào)控纖維化以外，也參與了凋亡過程，可通過TGF-β1/Smads信號通路導(dǎo)致凋亡的激活[4-7]。因此，芪丹利心丸對心肌細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，心肌梗死大鼠TGF-β1/Smads信號通路發(fā)生了過度激活，芪丹利心丸能夠降低TGF-β1及下游Smad 2、Smad 3的表達(dá)，這與文獻(xiàn)報道[8，19]一致。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了芪丹利心丸對凋亡通路中Bcl-2、Bax以及Caspase蛋白表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，心肌梗死大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)減少而Bax蛋白表達(dá)增加，并且Bcl-2/Bax比值減小，而芪丹利心丸可顯著改善Bcl-2和Bax蛋白的異常表達(dá)。對于細(xì)胞凋亡，可看作是一個由Bcl-2家族和Caspase家族蛋白質(zhì)執(zhí)行程序化、規(guī)范化命令的過程，Bcl-2、Bax以及Caspase蛋白在其中發(fā)揮了重要作用[20-22]。Bcl-2蛋白作為Bcl-2家族中的保護(hù)性蛋白，廣泛存在于核膜外、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及線粒體內(nèi)膜而抑制凋亡的發(fā)生，Bax蛋白作為Bcl-2蛋白同源體可促進(jìn)凋亡的發(fā)生。Bcl-2和Bax的比值直接決定了線粒體外膜各種通道的開放程度，使其通透性發(fā)生改變，引起細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致Caspase通路的活化和凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，心肌梗死后Caspase-9和Caspase-3表達(dá)增加。Caspase-9和Caspase-3是Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白，心肌缺血后，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到胞漿與Apaf-1結(jié)合，募集并激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3，啟動凋亡程序[20]。因此，心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加。本研究中芪丹利心丸可降低Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明芪丹利心丸能夠減輕心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路，改善Bcl-2、Bax及Caspase蛋白表達(dá)有關(guān)。