楊天舒，瞿惠燕，戎靖楓，劉 茜，周 華

再灌注治療是有效保護(hù)缺血心肌免受梗死的有效方式，但是再次恢復(fù)血供后，心肌缺血再灌注損傷常常發(fā)生，不僅未能實(shí)現(xiàn)正常的心臟功能，反而加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。因此，心肌缺血再灌注損傷已成為心肌缺血病人術(shù)后心臟損傷的最主要原因，積極尋找心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制及解決方法成為亟須解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

腸道作為人體最大免疫器官，在提取能量、控制局部和全身免疫方面扮演著重要角色。研究表明，腸道菌群與多種疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如肥胖、糖尿病、胃腸疾病、癌癥和心血管疾病等[1]。其中，腸道菌群與心血管疾病的研究尤為引人關(guān)注[2]，其代謝產(chǎn)物如膽堿類物質(zhì)，可導(dǎo)致心肌纖維化[3]。近年來(lái)，隨著人們飲食習(xí)慣的改變，瘦肉及蛋黃的攝取量增加，導(dǎo)致膽堿類食物食用過(guò)量。據(jù)報(bào)道，與健康人相比，患有冠心病病人的乳桿菌目明顯增加，擬桿菌門明顯減少[4]。說(shuō)明患有冠心病的病人與正常人菌群結(jié)構(gòu)有一定差異。鹿紅顆粒是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院周華教授運(yùn)用中醫(yī)學(xué)“益氣溫陽(yáng)，活血利水”理論，在總結(jié)多年臨床治療心臟重構(gòu)經(jīng)驗(yàn)成果的基礎(chǔ)上，探索研制而成的中藥劑型，由鹿角、桂枝、黃芪、黨參、紅花和葶藶子組成。方中黃芪、黨參益氣健脾、扶正固本，對(duì)于提高腸道免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂有較好療效；鹿角、紅花、桂枝溫陽(yáng)活血，給予腸道血供，防止腸黏膜充血水腫，改善腸黏膜屏障功能；葶藶子利水消腫，促進(jìn)體循環(huán)中膽堿排泄。諸藥合用，共奏益氣健脾、活血利水之功效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、試劑與儀器 鹿紅顆粒購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：57-33-0)；萬(wàn)古霉素購(gòu)自上海源液生物科技有限公司(批號(hào)：1404-93)。

1.1.2 動(dòng)物 雄性成年健康無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(180±30)g，8周齡，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)；飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)室溫度25 ℃，濕度30%，光照周期12 h，自由進(jìn)食普通標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用純凈水。實(shí)驗(yàn)倫理證號(hào)：PZSHUTCM190322020。

1.1.3 儀器 動(dòng)物呼吸機(jī)，江西特力公司(型號(hào)：TRCI-200A)；多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)，美國(guó) BIOPAC公司；全自動(dòng)免疫分析儀，美國(guó)雅培公司(型號(hào)AXSYM)；微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)(MB-80)， 北京金山川公司。全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Abbott公司(型號(hào)：AXSYM)；多功能超聲診斷儀(型號(hào)：IE33)荷蘭Philips公司；倒置顯微鏡(型號(hào)：4kx4l)。日本Olympus公司。

1.2 動(dòng)物分組與造模 按照隨機(jī)原則對(duì)大鼠進(jìn)行分組，分為假手術(shù)組、模型組、鹿紅顆粒組、萬(wàn)古霉素組，每組10只。鹿紅顆粒組預(yù)處理，給予鹿紅顆粒0.5 mL/(kg·d)灌胃；萬(wàn)古霉素組給予萬(wàn)古霉素0.075 mg/(300 mL·d)；假手術(shù)組、模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組預(yù)處理灌胃5 d。

Wistar大鼠用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，行氣管插管并用呼吸機(jī)輔助通氣(通氣頻率為80次/分、潮氣量為2～4 mL)。左側(cè)3～5肋間處打開胸腔，切開心包膜，擠壓出心臟后，在肺動(dòng)脈下2～3 mm處用7號(hào)細(xì)線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；結(jié)扎成功[心室前壁顯示蒼白色，心電圖Ⅱ?qū)?lián)的ST段弓背向上升高(紙速50 mm/s)，表明結(jié)扎成功]后，迅速將心臟放回胸腔，然后用浸生理鹽水的紗布覆蓋胸腔，維持呼吸機(jī)呼吸，結(jié)扎后40 min再灌注180 min。假手術(shù)組只給予開胸后左前降支穿線，但不進(jìn)行結(jié)扎。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血清檢測(cè) 大鼠處死后，取腹主動(dòng)脈血，3 000 r/min離心10 min，即得到血清，根據(jù)試劑盒操作方法提示，利用全血信息分析系統(tǒng)檢測(cè)其心功能相關(guān)指標(biāo)肌酸激酶。

1.3.2 病理染色 將大鼠心臟和小腸固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成6 μm切片。心臟樣品用Masson染色以分析心肌纖維化。小腸用蘇木精-伊紅(HE)染色以分析組織形態(tài)。

1.3.3 糞便取樣測(cè)序 取大鼠直腸糞便樣品(約2粒)收集在無(wú)菌管中，短暫存放于液氮中，后儲(chǔ)存在-80 ℃等待檢測(cè)。使用E.Z.N.A.?soil 試劑盒 (Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.)對(duì)總 DNA 進(jìn)行抽提，利用 Nano Drop 2000檢測(cè)DNA 濃度和純度，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取的質(zhì)量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物對(duì)V3-V4 可變區(qū)間進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp?9700型)。擴(kuò)增體系為20 μL、4 μL 5＊FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA 模板。使用 2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences， Union City，CA，USA) 進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，利用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST (Promega， USA) 進(jìn)行檢測(cè)定量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清肌酸激酶水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清肌酸激酶水平升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅顆粒組及萬(wàn)古霉素組大鼠血清肌酸激酶水平降低(P<0.05)；與萬(wàn)古霉素組比較，鹿紅顆粒組大鼠血清肌酸激酶水平降低(P<0.01)。詳見圖1。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05；與鹿紅顆粒組比較，△ P<0.05。圖1 各組大鼠血清肌酸激酶水平比較

2.2 對(duì)心肌組織心肌纖維化病理學(xué)的影響 使用Masson染色觀察心肌組織病理學(xué)變化，藍(lán)色染色顯示心肌組織中的膠原纖維。與假手術(shù)組比較，模型組纖維化程度增加明顯；鹿紅顆粒組纖維化程度較輕，僅在血管周圍顯示纖維化反應(yīng)；萬(wàn)古霉素組較模型組纖維化程度較輕，但在血管周圍纖維化程度較鹿紅顆粒組重。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌Masson染色切片圖

2.3 對(duì)盲腸組織病理學(xué)的影響 使用HE染色觀察盲腸組織中的病理學(xué)變化，假手術(shù)組大鼠腸絨毛排列整齊，間隙??；模型組間隙排列紊亂，絨毛間隙大，炎癥明顯；萬(wàn)古霉素組絨毛排列較整齊，但間隙變大；鹿紅顆粒組絨毛排列整齊，較萬(wàn)古霉素組改善了絨毛間隙。詳見圖3。

圖3 各組大鼠盲腸HE染色切片圖

2.4 大鼠腸道微生物群群落venn圖分析 通過(guò)venn圖分析發(fā)現(xiàn)，不同顏色代表不同分組，重疊部分?jǐn)?shù)字代表多個(gè)分組中共有的物種數(shù)目，非重疊部分?jǐn)?shù)字代表對(duì)應(yīng)分組所特有的物種數(shù)目。通過(guò)venn圖發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組(152)相比，模型組菌群豐度降低(143)；與模型組相比，鹿紅顆粒組(165)菌群豐度增加。與模型組(143)及鹿紅顆粒組(165)相比，萬(wàn)古霉素組菌群豐度降低(140)。詳見圖4。

圖4 各組大鼠腸道微生物venn圖

2.5 大鼠腸道微生物群群落柱形圖分析 鹿紅顆粒在減緩心肌缺血再灌注損傷的同時(shí)影響了腸道微生物組成。模型組明顯增加大腸埃希菌(Escherichia)的豐度，假手術(shù)組及鹿紅顆粒組大腸埃希菌菌群豐度則較低，萬(wàn)古霉素組大腸埃希菌的豐度較假手術(shù)組及鹿紅顆粒組的豐度提高，較模型組的豐度水平降低。詳見圖5。

圖5 大鼠腸道微生物群落

3 討 論

心血管疾病與腸道菌群相互聯(lián)系、相互作用[5-6]。經(jīng)抗生素干預(yù)后，能明顯改善心肌損傷。究其機(jī)制是通過(guò)抑制腸道菌，降低血漿中內(nèi)毒素水平，改善心肌缺血再灌注損傷。腸源性內(nèi)毒素攻擊發(fā)生在89%的急性心肌梗死病人中，并且可能是疾病誘導(dǎo)或進(jìn)展的一個(gè)因素[7]。研究證明，給予抗生素治療，在第14天效果達(dá)到最佳，其后易產(chǎn)生耐藥性，易打破菌群平衡，只能短期服用。而給予大鼠飲用水中添加萬(wàn)古霉素，改變了糞便中存在的微生物種類的豐度并減少了總微生物數(shù)量。在抑制腸道有害菌的同時(shí)也抑制了腸道中“益生菌”[8]，因此，許多臨床試驗(yàn)皆以失敗告終[9]。近年來(lái)，益生元和益生菌已廣泛用于治療某些疾病，并已顯示出很好的效果。而益生元品種過(guò)于單一，亟須研究多種藥物促進(jìn)益生元及益生菌生長(zhǎng)。

《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)》云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾。脾氣散精，上歸于肺；通調(diào)水道，下輸膀胱”。中藥在人體內(nèi)代謝也要經(jīng)歷此途徑。許多中草藥并不是本身發(fā)揮藥效，而是作為藥物前體，與腸道菌群相互作用。正常腸道主要的細(xì)菌門，按重要性順序依次是厚壁菌門、擬桿菌、放線菌、變形桿菌、疣粒菌和梭桿菌[10]。大腸埃希菌是人體不可缺少的單細(xì)胞生物。大腸埃希菌俗名大腸桿菌(革蘭陰性短桿菌)，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽。大腸埃希菌的致病物質(zhì)之一是血漿凝固酶。本研究結(jié)果證明，鹿紅顆粒減緩心肌缺血再灌注損傷的同時(shí)影響了腸道微生物組成，明顯增加了腸道微生物物種的多樣性與豐度。

長(zhǎng)期吃低膳食纖維或高脂肪食物會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的內(nèi)毒素釋放，破壞腸道黏膜，造成腸壁滲漏，并可吸收入血[11]。心肌梗死發(fā)生后，導(dǎo)致心排血量減少和體循環(huán)淤血，一方面，可以導(dǎo)致腸道血流灌注減少，腸黏膜充血水腫，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能破壞。腸黏膜屏障功能的這種破壞反過(guò)來(lái)可改變腸道通透性、細(xì)菌移位、循環(huán)內(nèi)毒素水平。另一方面，可改變腸道菌群的種類與豐度。

鹿紅顆粒主要由鹿角、桂枝、黃芪、黨參、紅花及葶藶子組成，具有益氣活血、補(bǔ)腎調(diào)心的功效[12]。研究證明，含有纖維、多酚、多糖和某些其他物質(zhì)的草藥配方，通過(guò)調(diào)節(jié)多種腸道微生物群，具有抗肥胖、抗糖尿病和抗心血管疾病的作用[13-15]。鹿紅顆粒所含的黃芪多糖、黨參多糖、桂枝多糖、黨參多酚、桂枝多酚等對(duì)于腸道益生菌有明顯促進(jìn)作用[16]。鹿紅顆粒通過(guò)改善腸黏膜淤血以改善腸黏膜通透性，防治內(nèi)毒素入血，從而改善心臟炎癥，改善心肌纖維化，減緩心肌缺血再灌注損傷。

腸道菌群種類繁多、數(shù)量龐雜，與多種疾病關(guān)聯(lián)密切。中醫(yī)藥因其來(lái)源天然，且有較少毒副作用，可為改善腸道菌群防治心血管疾病提供新思路。