應(yīng)靜 吳晉 姚利峰

急性腎損傷（acute kideny injury，AKI）是膿毒癥患者最常見的并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，64.4%的膿毒癥患者發(fā)展為AKI[1]，而且膿毒癥致AKI患者病死率顯著增加，是非膿毒癥致AKI及單純膿毒血癥患者的5倍[2-3]，目前尚缺乏有效的治療措施[4]。川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎的根中提取的生物堿，長期用于治療缺血缺氧性心血管疾病[5]。最近的基礎(chǔ)和臨床研究表明，川芎嗪具有廣泛的藥理作用，如抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、保護(hù)腎臟、抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡等[6-10]。但是川芎嗪對膿毒癥所致AKI的影響，目前尚未見到相關(guān)報(bào)道。本研究將川芎嗪用于膿毒癥小鼠模型，旨在探討川芎嗪對膿毒癥AKI小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠54只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），6～8周齡，體重20～25 g。主要試劑：鹽酸川芎嗪（平光制藥股份有限公司）。蘇木精-伊紅（美國SIGMA公司）。一抗Anti-vWF antibody（Proteintech公司）。二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。主要儀器：數(shù)碼相機(jī)（佳能505D）、電子天平（蘇測電子科技有限公司，SC-AC-1200AS型）、超低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)，DW-86L388型）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，PYX-DHS500BS-Ⅱ型）、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（LEICA公司，RM2235型）、病理組織漂烘儀（常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司，Tec 2500型）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將54只小鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)化區(qū)組分為5組：假手術(shù)組10只，安慰劑組、川芎嗪低劑量組、川芎嗪中劑量組、川芎嗪高劑量組各11只。

1.2.2 膿毒癥模型建立及分組給藥 采用盲腸結(jié)扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）手術(shù)建立小鼠膿毒癥模型。假手術(shù)組：只做剖腹關(guān)腹，不行CLP。安慰劑組：先予尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.15 ml，預(yù)處理30 min后行CLP造模。川芎嗪低、中、高劑量組：根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]，分別尾靜脈注射不同濃度川芎嗪（10、30、60 mg/kg川芎嗪溶于0.15 ml 0.9%氯化鈉注射液中），預(yù)處理30 min后CLP造模。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察5組小鼠造模后6 h、12 h、24 h、3 d存活率。造模后第3天每組存活的小鼠中隨機(jī)取5只，用代謝籠采集24 h小鼠尿液，然后4%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，通過摘除眼球放血法處死，并眼眶采血1 ml左右。小鼠放血死亡后立即取出腎臟，以蒸餾水反復(fù)沖洗除去血污，光鏡下拍照。留取左側(cè)腎臟標(biāo)本，剪一半用以檢測腎臟含水量，另一半腎臟凍存。右側(cè)腎臟4%甲醛固定后送病理檢查。

1.3.1 腎臟含水量檢測 將半個(gè)腎臟稱其濕重后，置于37℃烘箱烘48 h后稱干重，以（濕重-干重）/濕重×100%計(jì)算腎臟含水量來判定腎臟的水腫程度。

1.3.2 腎組織病理學(xué)檢查 將4%甲醛固定的腎臟標(biāo)本經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋切片（厚度4 μm），行HE染色，光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及炎癥情況，并進(jìn)行半定量評分，腎小管上皮有無凋亡、壞死或絨毛減少（1分），腎小管管腔有無擴(kuò)張（1分），腎間質(zhì)有無管型（1分）或炎癥浸潤（1分），腎間質(zhì)有無充血或腎小球毛細(xì)血管瘀血（1分），每有1項(xiàng)加1分，總分為5分，0分代表無明顯病變，評分越高則表示腎損傷程度越重。

1.3.3 腎損傷分子1（kidney injury molecule 1，Kim-1）水平的測定 采用ELISA法。將小鼠尿液樣本以1 000 r/min離心10 min。取離心后的上清液100 μl添加至ELISA板上，在37℃溫育1 h后棄去孔內(nèi)液體。然后順序加反應(yīng)試劑A和B，甩干后加底物溶液90 μl，在37℃避光顯色20 min，最后加終止液50 μl。在確保板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡，立即用酶標(biāo)儀于450 nm波長測量各孔的光密度值（OD值）。

1.3.4 內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物血管性血友病因子（von Willebr and Factor，vWF）表達(dá)的檢測 采用免疫組化法。將4%甲醛固定的腎臟標(biāo)本經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋切片（厚度 4 μm）。采用一抗 Anti-vWF antibody（稀釋 1∶50，美國Proteintech公司）、二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（無稀釋，中杉金橋生物技術(shù)有限公司），然后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行比色檢測，在光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察并獲得圖像。染色結(jié)果采用半定量分析方法：以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計(jì)分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細(xì)胞百分比即每張免疫組化切片選擇5個(gè)不同的視野（×200）觀察：0～5%為 0分，6%～25%為 1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%均為4分。最終分值以陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度之和表示，0分為陰性，3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強(qiáng)陽性。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠存活率的比較 在CLP術(shù)后第3天，安慰劑組小鼠的存活率明顯低于假手術(shù)組（表1），第3天存活率僅為45.5%。川芎嗪預(yù)處理可提高小鼠存活率，川芎嗪高劑量組小鼠存活率最高（與假手術(shù)組相似）。

表1 5組小鼠存活率的比較[只（%）]

2.2 5組小鼠腎臟含水量的比較 安慰劑組小鼠腎臟含水量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與安慰劑組相比，經(jīng)過川芎嗪預(yù)處理的小鼠腎臟含水量明顯降低（P＜0.05）。此外，川芎嗪高劑量組小鼠腎臟含水量降低到與假手術(shù)組小鼠相似的水平。見表2。

表2 5組小鼠腎臟含水量的比較（%）

2.3 5組小鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)分析 鏡下觀察可見，假手術(shù)組無明顯組織學(xué)病變，安慰劑組腎組織損傷最嚴(yán)重，不同的樣本中可以發(fā)現(xiàn)腎小管內(nèi)管型及擴(kuò)張，明顯的腎間質(zhì)炎癥，腎小管上皮水腫、凋亡和間質(zhì)充血及小球毛細(xì)血管淤血（圖1，插頁）。對腎臟的組織學(xué)特征進(jìn)行半定量評分（表3），安慰劑組評分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與安慰劑組相比，川芎嗪中劑量組和高劑量組評分明顯降低（均P＜0.05）。

圖1 5組小鼠腎臟組織病理結(jié)果（紅色箭頭示蛋白管型，藍(lán)色箭頭示間質(zhì)充血或小球毛細(xì)血管淤血，黃色箭頭示腎小管擴(kuò)張，HE染色，×200）

2.4 5組小鼠尿液Kim-1水平的比較 安慰劑組尿液Kim-1水平較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01），與安慰劑組相比，川芎嗪低劑量組尿液Kim-1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，川芎嗪中劑量和高劑量組尿液Kim-1水平顯著降低（P＜0.05），見表 4。

表3 5組小鼠腎臟病理損傷評分的比較（分）

表4 5組小鼠尿液Kim-1水平的比較（pg/ml）

2.5 5組小鼠vWF表達(dá)的比較 鏡下觀察可知，vWF表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性呈黃棕色（圖2，插頁）。安慰劑組vWF表達(dá)評分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與安慰劑組相比，川芎嗪低、中、高劑量組vWF表達(dá)評分明顯降低（P＜0.05），且隨著川芎嗪劑量的增高評分依次降低，高劑量組表達(dá)最低，接近假手術(shù)組水平，見表5。

圖2 5組小鼠腎臟組織vWF表達(dá)的影響（CLP術(shù)后3 d，免疫組化檢測小鼠腎組織vWF表達(dá)，vWF表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性呈黃棕色）

表5 5組小鼠vWF表達(dá)的比較（分）

3 討論

膿毒癥以器官功能障礙為特征，長期以來被推測與AKI的發(fā)展有關(guān)，膿毒癥合并AKI是危重患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能夠?qū)е禄颊卟∷缆曙@著增加[4，13]。研究表明，這種病理改變可以通過外科手術(shù)（CLP）來實(shí)現(xiàn)，CLP常用于膿毒癥實(shí)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)研究[14]。本研究通過CLP手術(shù)成功建立了小鼠膿毒癥模型，并產(chǎn)生了嚴(yán)重的腎臟損傷。結(jié)果顯示，安慰劑組小鼠的存活率明顯低于假手術(shù)組，第3天存活率僅為45.5%，假手術(shù)組為100%。安慰劑組小鼠腎臟含水量明顯高于假手術(shù)組，腎臟水腫嚴(yán)重，HE染色下可見安慰劑組小鼠腎組織損傷最嚴(yán)重，不同的樣本中可以發(fā)現(xiàn)腎小管內(nèi)管型及擴(kuò)張，明顯的腎間質(zhì)炎癥，腎小管上皮水腫、凋亡和間質(zhì)充血及小球毛細(xì)血管瘀血，而假手術(shù)組小鼠腎組織無明顯病理改變。在膿毒癥相關(guān)的AKI中，Kim-1是一個(gè)重要的急性腎臟損傷標(biāo)志物[15]，尿液Kim-1水平升高可以較早的提示發(fā)生了腎小管損傷[16-17]。本研究同樣觀察到安慰劑組小鼠尿液中Kim-1水平較假手術(shù)組有明顯增高（P＜0.01）。

目前膿毒癥造成腎臟損傷機(jī)制還不完全明了，但多數(shù)研究認(rèn)為與以下因素有關(guān)：炎性介質(zhì)、凝血功能異常、腎缺血再灌注、內(nèi)毒素、細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活與損傷扮演了非常重要的角色。研究表明，膿毒癥進(jìn)展中大量釋放的內(nèi)毒素既能夠刺激機(jī)體炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大激活并通過炎癥反應(yīng)來引起內(nèi)皮細(xì)胞損害，也能直接作用于血管內(nèi)皮，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18-19]。受損的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生血管擴(kuò)張因子減少，氧化應(yīng)激水平明顯提高，血管內(nèi)壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞，腎毛細(xì)血管腫脹閉塞、通透性增加，導(dǎo)致腎微循環(huán)功能障礙，這可能是膿毒癥所致AKI發(fā)生的重要血流動(dòng)力學(xué)因素[20-21]。vWF是體內(nèi)止血和血栓形成的主要血漿成分，90%以上的血液循環(huán)中vWF是由內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放的。內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂后產(chǎn)生vWF增多，導(dǎo)致局部臟器呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，微血栓形成，加重微循環(huán)功能障礙。因此vWF可以作為反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的靈敏生物學(xué)指標(biāo)[22]。本研究中，免疫組化顯示假手術(shù)組小鼠腎組織vWF低表達(dá)，安慰劑組小鼠vWF表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，也提示膿毒癥小鼠腎組織內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷。因此調(diào)整腎血管內(nèi)皮細(xì)胞功能可能為膿毒癥相關(guān)的AKI患者提供一種潛在的治療選擇。

川芎嗪作為從傳統(tǒng)中草藥川芎中提取的生物堿，被證實(shí)對循環(huán)系統(tǒng)和血管內(nèi)皮系統(tǒng)有廣泛的藥理作用，已廣泛應(yīng)用于冠心病、缺血性腦血管病、血栓閉塞性血管病、肺動(dòng)脈高壓以及肺心病的治療。很多研究證實(shí)川芎嗪具有腎臟保護(hù)功能，川芎嗪可以減輕小鼠和大鼠的腎缺血再灌注損傷[23-24]，可以抑制抗癌藥物順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎小管凋亡[25]，還被證實(shí)可以抑制阿霉素、慶大霉素誘導(dǎo)的大、小鼠腎小管細(xì)胞凋亡[26-28]。但是對膿毒癥所致AKI的影響目前尚不清楚。

本研究使用川芎嗪治療CLP手術(shù)誘導(dǎo)的膿毒癥AKI小鼠，發(fā)現(xiàn)川芎嗪預(yù)處理能顯著減輕腎臟損傷，保護(hù)腎功能，提高膿毒癥AKI小鼠生存率。與安慰劑組相比，川芎嗪組小鼠生存率顯著提升，川芎嗪高劑量組小鼠3 d存活率達(dá)到100%。川芎嗪各劑量組小鼠的腎臟含水量也較安慰劑組明顯降低，提示川芎嗪改善了腎臟的水排泄功能，有助于減輕腎功能障礙。小鼠腎組織HE染色后高倍鏡下觀察可知，假手術(shù)組小鼠無明顯腎組織學(xué)改變，安慰劑組則發(fā)生明顯的腎組織病理損傷。與安慰劑組相比，川芎嗪組，特別是中劑量組和高劑量組小鼠的腎組織學(xué)病理損傷評分明顯降低，川芎嗪各劑量組隨著川芎嗪劑量增高腎組織損傷逐漸減輕，這表明川芎嗪對膿毒癥AKI小鼠有積極的治療作用。小鼠尿液Kim-1水平變化也提示了川芎嗪對膿毒癥AKI小鼠腎臟的保護(hù)作用，與安慰劑組相比，川芎嗪中劑量和高劑量組尿液Kim-1水平顯著降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，vWF表達(dá)在安慰劑組小鼠腎組織中顯著升高，而在川芎嗪各劑量組則顯著降低，且隨著川芎嗪預(yù)處理劑量的增加依次降低，川芎嗪高劑量組的vWF表達(dá)已經(jīng)降低到接近假手術(shù)組的程度，表明川芎嗪能有效減輕膿毒癥AKI小鼠腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。川芎嗪保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制很廣泛，有研究認(rèn)為川芎嗪可能是通過保護(hù)超氧化物歧化酶和谷光甘肽過氧化物酶活性，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[29]；也有多項(xiàng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)川芎嗪對氧化應(yīng)激、缺血缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用[30-31]。這些研究為川芎嗪保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ)。

綜上所述，在小鼠的膿毒癥所致AKI中，川芎嗪能有效減輕腎臟損傷，保護(hù)腎功能，該作用可能與川芎嗪對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)，需要進(jìn)一步研究來尋找川芎嗪保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，保護(hù)膿毒癥所致AKI的分子機(jī)制。