劉 靜，楊富民 *，王麗君，蘇阿倫

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030）

伯克霍爾德菌是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌。1949年美國(guó)植物病理學(xué)家BURKHOLDER WH等[10]首次發(fā)現(xiàn)它可以引起洋蔥莖腐爛，稱為洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia），1992年YABUUCHI E等[11]正式將該菌及其他6個(gè)屬于rRNA群的假單胞菌歸為一個(gè)新屬，即伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）。伯克霍爾德菌能產(chǎn)生多種具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物如鐵載體（Pyochenlin，Pyoverdine）、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、單萜生物堿、Cepaciamide A、Cepacidine A、Cepacin A等[12-14]。對(duì)于伯克霍爾德菌抑菌物質(zhì)的分離基本遵循三步走原則，目前相關(guān)的報(bào)道并不多，權(quán)春善等[15]通過Sephadex-75pg及Sephacryl S-100兩步柱層析，然后用HPLC分離，成功實(shí)現(xiàn)了洋蔥伯克霍爾德菌CF-66抑菌物質(zhì)的純化；任嘉紅等[16]利用硫酸銨分級(jí)鹽析、Sephadex G-50葡聚糖凝膠層析和DEAE-Sephadex A-25高流速離子型葡聚糖凝膠層析對(duì)吡咯伯克霍爾德菌JK-SH007產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了純化；陳京元等[17]利用超濾、Sephadex G-25凝膠柱層析對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌C23抗真菌活性多肽進(jìn)行了分離，并確定了其分子質(zhì)量，成為首個(gè)報(bào)道的伯克霍爾德菌屬產(chǎn)分子量超過5 000 Da的多肽。

本實(shí)驗(yàn)從甘肅省地方特色發(fā)酵產(chǎn)品-隴西臘肉中成功的分離出一株具有抑菌活性的菌株，經(jīng)16S rDNA全序列測(cè)序，鑒定為伯克霍爾德菌（Burkholderia），在前期研究的基礎(chǔ)上，利用不同濃度的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀，高速離心獲得的沉淀經(jīng)兩次固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）小柱層析，粗分離液分別用制備型和分析型高效液相色譜進(jìn)一步純化，以期獲得純物質(zhì)，為后續(xù)抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析及抑菌機(jī)理的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

伯克霍爾德菌：由本實(shí)驗(yàn)室前期分離保藏；金黃色葡萄球菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538）：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；種子培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基、腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；硫酸銨、NaH2PO4·2H2O（均為析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Na2HPO4·12H2O（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硝酸（分析純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（分析純）：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；乙醇、磷酸（均為析純）：天津市百世化工有限公司；牛血清蛋白（純度＞98%）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；固相萃取小柱：北京振翔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀、Evolution 60紫外分光光度計(jì)、Kromasil 100-5-C18色譜柱：美國(guó)Thermo Fisher公司；1200 Infinity Series高效液相色譜儀、CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱：美國(guó)Agilent公司；DUO-PUR1308酸純化儀：意大利Milestone公司；AE 200分析天平：瑞士Mettler公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；Syncore平行蒸發(fā)定量濃縮儀：瑞士Buchi公司；PPM48正壓固相萃取儀：美國(guó)J2 Scientific公司；CL-32L高壓滅菌器：日本ALP公司；IPP260plus恒溫培養(yǎng)箱：德國(guó)Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)室保存的伯克霍爾德菌接種于種子培養(yǎng)基中，在36 ℃的培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，取出后3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，用0.45 μm的濾膜過濾除菌，即得發(fā)酵上清液。

1950年8月，李鐵夫從香港回到廣州，任華南文藝學(xué)院名譽(yù)教授、華南文聯(lián)副主席，住在華南文藝學(xué)院內(nèi)（即廣州光孝寺）。李鐵夫于1952年6月在廣州逝世，按其生前將全部作品捐獻(xiàn)給國(guó)家的遺愿，其隨身作品、遺物由華南文藝學(xué)院保管。1953年，華南文藝學(xué)院并入“中南美專”。中南美專設(shè)在武漢，李氏作品隨即運(yùn)往武漢。1958年，中南美專遷至廣州并更名為“廣州美術(shù)學(xué)院”，李鐵夫藏品也回到廣州，收藏在廣州美術(shù)學(xué)院美術(shù)館（2003年以前稱“陳列館”）。

活化：挑取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，在BHI培養(yǎng)基上劃線分離，放入36 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，傳代2～3次，得到標(biāo)準(zhǔn)菌的純菌株。增菌：挑取單菌株，接種到7.5%氯化鈉肉湯中，在36 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

在平板中傾倒10～15 mL 50 ℃左右的Baird-Parker培養(yǎng)基，取200 μL已稀釋至10-5的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌增菌液，用L棒均勻的涂布于該培養(yǎng)基表面，然后在表面放置牛津杯，在牛津杯中加入200 μL實(shí)驗(yàn)菌的發(fā)酵上清液，放入36 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出觀察抑菌圈大小，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

1.3.2 硫酸銨沉淀試驗(yàn)

向制備好的發(fā)酵上清液中添加硫酸銨至飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，高速離心（10000 r/min）分離上清液和沉淀，分別測(cè)定不同飽和度上清液和沉淀對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。將添加了70%硫酸銨的發(fā)酵液在離心機(jī)上10 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，沉淀用蒸餾水溶解，備用。

1.3.3 固相萃取小柱層析

將固相萃取小柱固定在正壓固相萃取儀上，用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.0）平衡30 min，取粗提液上樣，用相同的緩沖溶液洗脫，洗脫速度為1.0 mL/min，洗脫2～3次，合并收集洗脫液，以相同的洗脫液和洗脫速度在固相萃取小柱上再洗脫一次，洗脫液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上80 ℃進(jìn)行旋蒸，沉淀用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.0）溶解，備用。

1.3.4 分離純化

將上述粗分離液用高效液相色譜儀進(jìn)行純化，HPLC色譜柱條件：色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A為20 mmol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，流動(dòng)相B為乙腈；進(jìn)樣量100 μL；柱溫為室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流速3.0 mL/min；時(shí)間10 min；洗脫條件為A：92%，B：8%（等度洗脫）。

將以上具有抗菌活性的組分用高效液相色譜儀進(jìn)一步純化，HPLC色譜條件：色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm）；進(jìn)樣量50 μL；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相A為20 mmol/L pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，流動(dòng)相B為甲醇；時(shí)間11 min；洗脫條件為A：98%，B：2%（等度洗脫）。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定菌株的蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白10 mg，溶于蒸餾水，并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取6只試管，其中0號(hào)試管加入1.0 mL的蒸餾水作空白對(duì)照，另外5只試管分別加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)充蒸餾水至1.0 mL，每只試管中加入5.0 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250 染色劑，搖勻，此標(biāo)準(zhǔn)系列的質(zhì)量濃度為0、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL，放置2～5 min，以0號(hào)管為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595 nm處比色。取經(jīng)過純化所得的待測(cè)試樣0.1 mL，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，再加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，搖勻，放置2～5 min，以0號(hào)管為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)595 nm處比色。蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式：

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量，μg/mL；A為由標(biāo)準(zhǔn)曲線算得待測(cè)液中蛋白質(zhì)，μg/mL；V1為測(cè)定用試樣體積，mL；V2為試樣定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨沉淀結(jié)果

添加不同比例的硫酸銨，分離上清液和沉淀后，分別做抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，飽和度為70%硫酸銨所得沉淀的抑菌效果最好，說(shuō)明該沉淀中抑菌物質(zhì)濃度較高，所以選擇飽和度為70%硫酸銨離心后的沉淀液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同比例硫酸銨處理后上清液和沉淀的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of supernatant and precipitation treated with ammonium sulfate of different proportions

2.2 抑菌物質(zhì)分離純化結(jié)果

2.2.1 固相萃取小柱分離

粗提液經(jīng)兩次固相萃取小柱層析并洗脫后，分別做處理前后的抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑大小，取平均值，結(jié)果見表2。由表2可知，兩次固相萃取小柱層析后抑菌圈直徑變化不大，說(shuō)明抑菌物質(zhì)損失較小，此粗分離液可繼續(xù)用于后續(xù)的分離純化。

表2 固相萃取小柱層析處理前后抑菌效果對(duì)比Table 2 Comparison of antibacterial effect of crude extract before and after treatment with solid phase extraction column chromatography

2.2.2 制備型HPLC純化

由圖1可知，層析液經(jīng)1200 Infinity Series HPLC純化后，出現(xiàn)3個(gè)吸收峰（分別用A、B、C表示），根據(jù)峰形分段收集各個(gè)峰，測(cè)定抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有峰C具有抑菌活性，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的抑菌圈直徑為17.42 mm，因此，利用Ultimate 3000分析型HPLC對(duì)峰C進(jìn)行進(jìn)一步純化。

圖1 制備型HPLC純化抗菌物質(zhì)Fig.1 Antibacterial substances purified by preparative HPLC

2.2.3 分析型HPLC純化

對(duì)組分C用Ultimate 3000 HPLC進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，調(diào)整洗脫液有機(jī)相比例為磷酸鹽緩沖溶液∶甲醇=98∶2，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在保留時(shí)間為5.783 min時(shí)出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明其是純化物質(zhì)。

圖2 組分C的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of fractionC

2.2.4 紫外光譜掃描

采用Ultimate 3000 HPLC對(duì)組分C的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在190～800 nm的掃描范圍內(nèi)，最大吸收波長(zhǎng)為223.06 nm，表明該純化物質(zhì)中可能包含肽鍵（肽鍵的最大吸收波長(zhǎng)在220 nm左右[18]）。

圖3 抗菌物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)Fig.3 Maximum absorption wavelength of antimicrobials

2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

由于組分C可能為蛋白質(zhì)，故利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。經(jīng)測(cè)定蛋白質(zhì)含量在0～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.005 97X-0.006 86，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 66。組分C樣品測(cè)試結(jié)果表明其蛋白質(zhì)含量為452 μg/mL。

3 討論

3.1 細(xì)菌素純化方法

目前，沒有一套成型通用的細(xì)菌素分離純化方法，需根據(jù)其多肽的性質(zhì)、產(chǎn)細(xì)菌素菌株的來(lái)源及特性設(shè)計(jì)純化的策略[16]，大多數(shù)細(xì)菌素的純化都遵循粗分離-中度純化-精制的步驟[17]。如果不了解將要純化的細(xì)菌素性質(zhì)，建議使用硫酸銨分級(jí)沉淀較好，如果對(duì)純度要求較高，可以多種方法結(jié)合使用[18]。由于對(duì)即將純化的細(xì)菌素性質(zhì)不甚了解，所以本文遵循一般原則，利用不同濃度的硫酸銨分級(jí)沉淀發(fā)酵上清液，通過對(duì)抑菌試驗(yàn)抑菌圈大小的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用70%的硫酸銨沉淀發(fā)酵上清液效果最好。

文獻(xiàn)報(bào)道的凝膠過濾層析中使用的層析柱多為填充柱，填充過程中難免產(chǎn)生氣泡，存在填料不緊湊、比表面積小等問題，從而導(dǎo)致分離效果不佳，本文采用未經(jīng)任何修飾的硅膠填充的固相萃取小柱進(jìn)行層析，該柱填料內(nèi)徑小且被高度壓縮，大大增加了被分離液體與填料的接觸面積，通過比較層析前后抑菌圈的變化，發(fā)現(xiàn)該方法可行性較強(qiáng)，而且操作步驟少，有利于抗菌物質(zhì)的保值。

在精制階段要使細(xì)菌素純度達(dá)到99%，大多采用反相高效液相色譜進(jìn)行純化[19]。本研究中層析液分別經(jīng)制備型和分析型高效液相色譜分離，最終得到了吸收峰在220 nm左右的純物質(zhì)。

3.2 細(xì)菌素蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

對(duì)細(xì)菌素蛋白質(zhì)含量的測(cè)定多采用考馬斯亮藍(lán)法，本研究參照文獻(xiàn)[20]的方法測(cè)定純化液的蛋白質(zhì)含量，經(jīng)測(cè)定該抗菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為452 μg/mL。不同的細(xì)菌素蛋白質(zhì)含量不盡相同，陳麗園等[21]對(duì)一株可以抑制雞白痢沙門氏菌的乳酸乳球菌蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其含量在0.75～1.52 mg/mL之間。劉文麗等[22]對(duì)一株屎腸球菌Y31進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)原發(fā)酵液蛋白質(zhì)濃度為0.60 mg/mL。賈麗艷等[23]分別測(cè)定一株枯草芽孢桿菌發(fā)酵液、硫酸銨沉淀液及酸沉淀液蛋白質(zhì)含量，分別為0.141 g/L、0.106 g/L、0.123 g/L。本研究中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素蛋白質(zhì)含量介于文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)之間。

4 結(jié)論

通過對(duì)抗菌物質(zhì)進(jìn)行粗分離-中度純化-精制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用70%的硫酸銨沉淀發(fā)酵上清液效果最好，未經(jīng)任何修飾的硅膠填充的固相萃取小柱具有很好的層析效果，層析液經(jīng)兩步高效液相色譜分離，最終得到了吸收峰在220 nm左右的純物質(zhì)，該抗菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量為452 μg/mL。