趙婉妤，胡力文，呂 鑫，許 欣 *，裴曉方，盧中明，杜禮泉，鄭 敏

（1.四川大學 華西公共衛(wèi)生學院（華西第四醫(yī)院），四川 成都 610041；2.四川省綿陽市豐谷酒業(yè)有限責任公司，四川 綿陽 621006）

中國酒文化源遠流長，自酒問世以來，始終作為一種情感交流的載體，展現(xiàn)獨特的消費理念和神奇魅力。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展進步，物質(zhì)文化水平的提高，人們對白酒的消費更加走向理性化，對白酒品質(zhì)提出了更高的要求，不僅要滿足飲時激活人體精神，而且更加注重飲后的體征感受，具體來說要“飲時爽口，飲后醉的慢，醒得快，酒后不干口、不上頭”[1-2]。對于白酒飲用舒適度的研究主要方式為專家評判，但人工評判主觀性過強，效率較低。張夢妍等[3]已初步建立白酒飲用舒適度評價模型，根據(jù)醉酒昏睡期小鼠的醉酒時間、醒酒時間對白酒飲用舒適度進行了評價，并成功應(yīng)用于多種白酒的測定，但是由于醉酒階段指標測定的影響因素較多，實驗結(jié)果的準確度、精密度較差，因此該評價模型的進一步優(yōu)化問題亟待解決。目前有研究依據(jù)乙醇在體內(nèi)的代謝差異，將急性醉酒分為三個階段：興奮期、共濟失調(diào)期及醉酒昏睡期[4-5]，提示針對醉酒不同階段進行研究的可能性，有研究者以此為基礎(chǔ)對白酒飲用舒適度評價模型進行了優(yōu)化[6]。

在急性醉酒的三個階段中，共濟失調(diào)期常伴隨明顯的肢體不穩(wěn)、動作不協(xié)調(diào)等癥狀[5]。研究表明，急性醉酒共濟失調(diào)是由于過量攝入乙醇造成的腦組織氧化損傷[7]，但共濟失調(diào)發(fā)生機制復(fù)雜，影響因素較多，且我國復(fù)雜的白酒釀造工藝賦予了酒體除乙醇外的眾多有利微量成分[8]。相比于靜態(tài)昏睡期，共濟失調(diào)階段動態(tài)的行為學表現(xiàn)則更能直觀準確地體現(xiàn)實驗動物的生理狀態(tài)，展現(xiàn)白酒飲用舒適度，且目前未見不同白酒對共濟失調(diào)效應(yīng)是否會產(chǎn)生不同影響的研究。故本研究以優(yōu)化的動物行為學實驗為基礎(chǔ)，結(jié)合乙醇代謝、急性損傷、氧化損傷等生理生化指標，在共濟失調(diào)階段比較分析不同白酒對醉酒小鼠的影響，探究白酒飲用舒適度評價指標靈敏度，彌補研究空白，為進一步優(yōu)化白酒飲用舒適度動物評價模型提供數(shù)據(jù)支撐，奠定實驗基礎(chǔ)，同時對不同白酒導致不同共濟失調(diào)效應(yīng)的原因進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2種白酒（酒精度48%vol）（編號分別為①號、②號）：由四川省綿陽市豐谷酒業(yè)有限公司提供，主要理化指標分析結(jié)果見表1。

表1 2種白酒主要理化指標分析結(jié)果Table 1 Results of main physical and chemical indexes analysis of 2 Baijiu samples

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Balb/c小鼠（雄性，日齡（42～48 d））：由北京維通利華實驗動物有限技術(shù)公司提供（許可證號：SCXK（京）2016-0011）。獨立通風籠具（individually wentilate cagesdul，IVC）飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～22℃，相對濕度60%～70%，由四川大學華西公共衛(wèi)生學院實驗動物中心提供（使用許可證號：SYXK（川）2018-011）。

乙醇（分析純）：成都海興化工試劑廠；乙醛測定試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司；神經(jīng)特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒：上海酶聯(lián)科技生物有限公司；肝素試劑、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測定試劑盒、脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxidation，LPO）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

平衡木裝置（60 cm×2 cm×2 cm）：實驗室自制；7890B氣相色譜儀：美國Agilent公司；7697A頂空進樣器：美國Agilent公司；ECTM-WAX色譜柱（30m×0.53mm×1.2μm）：美國Alltech公司；HeraeusTMFrescoTM21微量離心機：美國ThermoScientific公司；Multiskan Go全波長酶標儀：美國Thermo Scientific公司；手持式勻漿器：美國Kimble公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理

120只Balb/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量分層后隨機分組，分為樣①組、樣②組、酒精對照組及空白對照組，分組情況見表2。

表2 實驗動物分組情況Table 2 Grouping of experimental animals

1.3.2 平衡木實驗

參考CRABBE J C等方法[9]，正式實驗前1天需要進行過梁訓練，將小鼠放置于平衡木一端，推動臀部或輕柔搖動尾部使其過梁，每只小鼠訓練兩次。禁食不禁水12 h，不同組別小鼠進行稱質(zhì)量并計算灌胃量。正式實驗前將小鼠移入測試房間適應(yīng)2 h，每只小鼠灌胃10 min后置于平衡木一端，觀察小鼠過梁情況，行走評分標準見表3。

表3 行走試驗評分標準Table 3 Score standards of walking tests

1.3.3 標本采集及檢測

不同組別小鼠過梁結(jié)束后，立即抓取固定使其眼球突出充血，用彎頭眼科鑷迅速鉗取眼球，使血液流入抗凝離心管（肝素鈉溶液100 μL）中，顛倒混勻后4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，-20 ℃冰箱保存。小鼠摘眼球取血后，頸椎脫臼處死，置于冰盤上，醫(yī)用解剖剪剪開頸部皮膚、人字縫，醫(yī)用直頭鑷剝開顱骨，輕輕取出腦組織，剔除結(jié)締組織和脂肪組織后，用預(yù)冷過的生理鹽水漂洗血跡，吸水紙吸干后電子天平稱質(zhì)量。按體料液比1∶1（g∶mL）加入生理鹽水在冰浴中進行勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取上清，-20 ℃冰箱保存。頂空氣相色譜法測定小鼠血漿中乙醇含量，酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠血漿中NSE含量，化學顯色法測定小鼠腦勻漿中乙醛、LPO、MDA含量、SOD、GSH-PX活力，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計及處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析和處理，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均值±標準差（X±S）表示，方差齊時進行單因素方差分析（one-way ANOVA），LSD檢驗進行組間兩兩比較；方差不齊時使用Kruskal-Wallis檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 行為學指標

共濟失調(diào)的發(fā)生與大腦、小腦及前庭系統(tǒng)等的損害密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為機體運動的協(xié)調(diào)不良、平衡障礙等。研究表明，乙醇暴露劑量控制在2.5～3.5 g/kg范圍內(nèi)能使小鼠產(chǎn)生明顯的共濟失調(diào)現(xiàn)象[10-11]，故根據(jù)前期預(yù)實驗，本研究采用8 mL/（kg·體質(zhì)量）（約3.0 g/kg）的單次灌胃劑量進行有效造模。平衡木實驗是評估小鼠肢體平衡以及肌肉運動協(xié)調(diào)能力的行為學方法。本研究參考崔海等[12-13]研究方法對平衡木行走評分標準進行了適當調(diào)整，即行走評分越高，共濟失調(diào)現(xiàn)象越嚴重。不同組別平衡木實驗行為學指標檢測結(jié)果見表4。

表4 平衡木實驗行為學指標檢測結(jié)果Table 4 Determination results of behavioral indicators by balance beam device tests

由表4可知，樣①組、樣②組、酒精對照組行走評分高于空白對照組，差異極顯著（P＜0.01）；樣②組行走評分低于酒精對照組，差異極顯著（P＜0.01）；樣①組行走評分高于樣②組，差異顯著（P＜0.05）；其余組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。酒精暴露組較空白對照組均出現(xiàn)明顯的共濟失調(diào)現(xiàn)象，提示乙醇在致共濟失調(diào)中的關(guān)鍵作用，但樣①組、樣②組較酒精對照組行走評分偏低，說明酒樣中除乙醇、水外的微量成分可能對小鼠機體具有一定的保護作用。白酒中雜醇、醛類、羧酸、酯類、酸類等微量成分約占1%～2%，其種類與比例的變化都會影響白酒的質(zhì)量和風味[14]，本研究發(fā)現(xiàn)樣①組與樣②組誘導產(chǎn)生的共濟失調(diào)程度不同，且差異具有統(tǒng)計學意義，提示平衡木實驗行為學指標能有效反映不同白酒引起的共濟失調(diào)效應(yīng)大小。

2.2 乙醇代謝指標

乙醇是親脂性小分子化合物，能迅速通過血腦屏障作用于腦組織。乙醛是乙醇的代謝產(chǎn)物，動物實驗證明攝入酒精的小鼠腦部乙醛含量明顯增加，且小腦含量更高，小腦是平衡中樞，由于乙醛其較強還原性，會致使腦部缺氧，出現(xiàn)站立不穩(wěn)等現(xiàn)象[15]。不同組別乙醇、乙醛含量檢測結(jié)果見表5。

表5 不同濃香型白酒對急性酒精中毒小鼠乙醇代謝的影響Table 5 Effect of different strong-flavor Baijiu on ethanol metabolism in mice with acute alcoholism

由表5可知，各組間血漿乙醇、腦勻漿乙醛含量差異不顯著（P＞0.05），與上述行為學結(jié)果不一致。由于乙醛的濃度與乙醇攝入量、乙醛加和物的形成、體內(nèi)代謝酶的活性等密切相關(guān)[16]，結(jié)合酒樣主要理化指標分析結(jié)果（即乙醇、乙醛、乙縮醛含量相近），可得出乙醛含量不能有效反映共濟失調(diào)的程度。

2.3 急性腦損傷指標

NSE是細胞能量代謝活動的關(guān)鍵酶，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元與神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中，當神經(jīng)元損傷或壞死后，NSE通過血腦屏障進入血液中，致使血清（或血漿）NSE水平升高，其含量可靈敏、特異地反映神經(jīng)元受損的程度[17-18]。不同組別神經(jīng)特異性烯醇化酶含量檢測結(jié)果見表6。

表6 血漿中神經(jīng)特異性烯醇化酶檢測結(jié)果Table 6 Determination results of neuron-specific enolase in plasma

由表6可知，樣①組、樣②組、酒精對照組血漿NSE含量高于空白對照組，差異極顯著（P＜0.01）；其余組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示，樣②組NSE含量稍低于樣①組、酒精對照組，提示②號酒樣所致的急性腦損傷程度更小，且NSE檢測水平趨勢與行走評分結(jié)果保持一致，提示血漿NSE含量可能與共濟失調(diào)水平呈正相關(guān)趨勢。由于樣①組、樣②組、酒精對照組小鼠酒精攝入量及血漿乙醇含量并無顯著差異，提示酒樣②中的微量成分可能有減輕乙醇對神經(jīng)元損傷的作用。

2.4 氧化損傷指標

酒精誘導的腦損傷與腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)有關(guān)[19]。MDA和LPO是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，常用作反映機體細胞氧化損傷程度的指標，由于SOD和GSH-PX活力高低可間接反映機體清除自由基的能力，故常聯(lián)合使用進行氧化損傷評價。不同組別氧化損傷相關(guān)指標檢測結(jié)果見表7。

表7 氧化損傷相關(guān)指標檢測結(jié)果Table 7 Determination results of indicators related to oxidative damage

由表7可知，樣①組腦勻漿MDA含量高于酒精對照組、空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或0.05）；其余組間差異無統(tǒng)計學意義；各組間腦勻漿SOD、GSH-PX活力、LPO含量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。研究發(fā)現(xiàn)不同組別間氧化損傷指標無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），考慮到實驗動物采用的是單次中劑量酒精暴露，且段玉香等[19-20]研究結(jié)果顯示，單次大劑量或者長期酒精暴露均可產(chǎn)生明顯的腦部氧化損傷，故提示可能與作用劑量大小或者酒精暴露時間長短有關(guān)。且由于白酒中的微量成分組成及比例十分復(fù)雜，酒體中的某一種或某一類微量成分會對氧化應(yīng)激造成不同的影響，具體的影響方式與程度需要進一步的實驗研究。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，同酒精濃度酒精暴露組（不同白酒以及乙醇溶液）將造成實驗動物不同程度的共濟失調(diào)效應(yīng)，具體可能是通過調(diào)控NSE的含量水平來產(chǎn)生影響。即飲用舒適度越高的酒飲后體內(nèi)生成的NSE含量水平越低，急性腦損傷越輕，產(chǎn)生的共濟失調(diào)效應(yīng)越小。提示可通過優(yōu)化的平衡木實驗測定動物行為學指標結(jié)合急性腦損傷指標來評價白酒的飲用舒適度。

本研究結(jié)果提示，同酒精濃度酒精暴露組（不同白酒以及乙醇溶液）引起的共濟失調(diào)效應(yīng)有明顯差異，且不同組間乙醇代謝、氧化應(yīng)激指標與行為學實驗結(jié)果并不完全一致，結(jié)合白酒的理化成分檢測結(jié)果分析，可能與白酒中微量成分組成和比例不同有關(guān)；但具體的原因與機制值得深入探究，后續(xù)研究將對該內(nèi)容繼續(xù)開展。